許斐鈺，陳 果，龍勝文，魏晨曦

（湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長沙 410081）

關(guān)鍵字：人腦膠質(zhì)瘤；TNFAIP1；TMZ；細(xì)胞侵襲；EMT

人腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的腫瘤，其發(fā)病率占全部原發(fā)腦腫瘤的40%以上，且具有很強的侵襲性和破壞性，預(yù)后差，復(fù)發(fā)率高，治療方法有限［1-2］。人腦膠質(zhì)瘤患者的治療模式包括手術(shù)后聯(lián)合放療和化療。替莫唑胺（temozolomide，TMZ）是一種烷化劑抗腫瘤藥物，能使DNA 的核苷酸甲基化并導(dǎo)致甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（O-6-methylguanine DNA methyltransferase，MGMT）異常，致使細(xì)胞中DNA 錯配修復(fù)系統(tǒng)無法正常作用，故常被用于輔助治療腦膠質(zhì)瘤。然而TMZ 通常只對缺乏MGMT 的患者有益，并且腦膠質(zhì)瘤標(biāo)準(zhǔn)治療后復(fù)發(fā)往往不可避免，最終導(dǎo)致膠質(zhì)瘤患者的死亡率很高，這對醫(yī)生和患者來說是一個不容樂觀的現(xiàn)實［3-6］。TMZ 雖然對治療腦膠質(zhì)瘤有一定的作用，但是也伴隨耐藥的發(fā)生。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是最初在胚胎發(fā)育過程中觀察到的一個過程。在此過程中，細(xì)胞失去上皮特征而獲得間充質(zhì)特性，從而增強了遷移性和侵襲性，這一過程在腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中也很重要［7］。最近的研究表明，EMT 與化療耐藥密切相關(guān)，阻斷EMT 通路可消除肺癌對抗葉酸化療的耐藥性［8］。在結(jié)腸直腸癌和胰腺癌中也發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)果［9-10］。因此，闡明膠質(zhì)瘤細(xì)胞中遷移和侵襲的分子機制和發(fā)現(xiàn)新的靶點可能是了解膠質(zhì)瘤對TMZ耐藥的關(guān)鍵。

腫瘤壞死因子α 誘導(dǎo)蛋白1（tumor necrosis factor α-induced protein 1，TNFAIP1）也被稱為B12 或BACURD2，最早在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，可被腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNFα）和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)表達(dá)［11］，其氨基酸序列含有保守的BR-C、TTK、BTB/Pox virus、zinc finger （POZ） domain 及增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）結(jié)合位點［12］。大量研究表明，TNFAIP1 對細(xì)胞的遷移、侵襲、凋亡和免疫應(yīng)答都有影響，且TNFAIP1 的異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生相關(guān)，包括乙型肝炎病毒感染、神經(jīng)性疼痛、阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）等［13-17］。最新研究表明，TNFAIP1 的異常表達(dá)在藥物引起的神經(jīng)毒性［18］和肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和致瘤性［19］中起關(guān)鍵性作用，然而TNFAIP1 在人腦膠質(zhì)瘤中的作用和潛在機制卻暫無報導(dǎo)。因此，本研究在U251 細(xì)胞中過表達(dá)TNFAIP1 后，聯(lián)合TMZ 處理，觀察U251細(xì)胞的遷移和侵襲能力的變化，并初步探討其機制，為臨床治療人腦膠質(zhì)瘤提供新的策略和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251 和大腸桿菌菌種E.coliTOP 10 由本實驗室保存；pCMV-Myc 質(zhì)粒（Clone-tech 公司，美國）；pCMV-Myc-TNFAIP 1 表達(dá)載體由實驗室構(gòu)建保存。TMZ（Sellect公司，美國）；RNA Trizol 提取試劑（Takara 公司，日本）；用于內(nèi)參檢測的微管蛋白Tubulin、甘油醛-3-磷酸脫氫酶蛋白（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（Sigma公司，美國）；Myc-Tag抗體（武漢三鷹公司）；TNFAIP1、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin和Snail 抗體（ABclonal 公司，美國）；辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔、羊抗鼠二抗（KPL Technologies 公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的高糖培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）培養(yǎng)液。細(xì)胞于10 cm 的皿中培養(yǎng)，并置于條件為37℃、5%CO2、飽和濕度恒溫的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，長至對數(shù)生長期時用于試驗。

1.2.2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

根據(jù)LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，本試驗以6 孔板為例，待細(xì)胞長至 70%～80%開始轉(zhuǎn)染，吸掉舊培養(yǎng)液，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗1次，加入2 mL DMEM，放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中。分別取100 μL opti-MEM稀釋脂質(zhì)體和質(zhì)粒DNA（脂質(zhì)體和質(zhì)粒DNA 的體積比例為2∶1），室溫靜置5 min。將稀釋好的DNA在渦旋振蕩器上滴加到脂質(zhì)體中，振蕩10 s 后室溫靜置30 min。將200 μL DNA/脂質(zhì)體混合物滴加到事先饑餓處理的細(xì)胞中，前后左右輕輕晃動培養(yǎng)板，混合均勻后放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，4 h 后，換成含有血清和抗生素的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.3 藥物處理

細(xì)胞在10 cm 培養(yǎng)皿中長至90%以上后，以細(xì)胞數(shù)量為2×106個鋪板于6 孔板中，每孔加2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液。15～24 h 后，待細(xì)胞在6 孔板中長至90%以上時吸去舊培養(yǎng)液，開始加藥。設(shè)置對照組0.01%的二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），試驗組分別加 0.1、0.2、0.3 mmol/L TMZ（為避免血清的干擾，藥物處理時培養(yǎng)基均不含血清），處理36 h。

1.2.4 細(xì)胞劃痕試驗

將細(xì)胞接種至6 孔板中，長至90%時吸去舊培養(yǎng)液，按1.2.2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和1.2.3 藥物處理的步驟對細(xì)胞進(jìn)行處理。藥物處理36 h 后用純DMEM 洗凈舊培養(yǎng)液，進(jìn)行劃痕試驗。用10 μL 槍頭劃痕，槍頭垂直于孔板平面，力度一樣，目的是為了讓傷口寬度保持一致。1 個6 孔板可沿直徑劃2 次。劃痕完后用純DMEM 洗凈漂浮的細(xì)胞3 次，后加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h 后取出，再用純DMEM 洗2 次后拍照，統(tǒng)計劃痕傷口愈合情況并分析其遷移率。

1.2.5 Transwell細(xì)胞侵襲試驗

將細(xì)胞鋪至6 孔板中，長至70%～80%時按1.2.2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和1.2.3 藥物處理的步驟對細(xì)胞進(jìn)行處理。藥物處理36 h 后用0.2%胰酶對細(xì)胞進(jìn)行消化，取2×104個細(xì)胞鋪于事先放置在24 孔板的小室的上室中（體積總量為200 μL），下室加入600 μL 含15%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的培養(yǎng)基，每個組設(shè)置3 個重復(fù)。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，將小室從24 孔板中取出，PBS 洗2 次，用干凈的棉簽輕輕地刮去小室內(nèi)部的細(xì)胞。注意避免接觸小室下部，防止拭去侵襲過去的細(xì)胞。隨后用4%的多聚甲醛固定30 min，PBS 洗3 次。最后用0.5%結(jié)晶紫染色液染色20 min，用PBS 輕輕淋洗小室數(shù)次至結(jié)晶紫染液洗凈，置于室溫干燥后在顯微鏡下拍照，統(tǒng)計從上室侵襲至下室的細(xì)胞個數(shù)并分析其侵襲率。

1.2.6 Western blot

用0.2%胰酶消化收集細(xì)胞，視細(xì)胞的量加入細(xì)胞裂解液RIPA lysis buffer（6 孔板每孔細(xì)胞加150 μL 裂解液），于冰上放置30 min 進(jìn)行裂解，1 400 r/min 離心5 min 之后抽提細(xì)胞全蛋白，用5%的濃縮膠和12%的分離膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，三乙醇胺緩沖液鹽水溶液-吐溫-20（triethanolamine buffered saline solution-Tween-20，TTBS）洗4 次，每次10 min，分別加入TNFAIP1、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、Snail、Tubulin 和GAPDH 抗體，4℃孵育過夜。次日，TTBS 洗4 次，每次10 min，后加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h 后TTBS 洗4 次，每次10 min，加ECL（electrochemiluminescence）顯影液，在全自動凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影。

1.3 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Image J 及Graph Pad Prism6 軟件分析作圖。試驗數(shù)據(jù)用統(tǒng)計軟件IBM SPSS 22 進(jìn)行分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用單因素方差分析和t檢驗來確定組間差異的顯著性，P＜0.05為有差異統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 TMZ抑制U251 細(xì)胞的遷移與侵襲

為了研究TMZ 對U251 細(xì)胞遷移與侵襲的影響，本試驗用0.1、0.2、0.3 mmol/L TMZ 處理U251 細(xì)胞36 h，采用細(xì)胞劃痕法及Transwell 試驗分別檢測藥物處理后U251細(xì)胞遷移與侵襲能力的變化，發(fā)現(xiàn)TMZ 以劑量依賴的方式抑制了U251 細(xì)胞的遷移和侵襲，如圖1a～1d 所示。這些數(shù)據(jù)表明，TMZ 具有以劑量依賴的方式抑制U251 細(xì)胞的遷移和侵襲的能力。

2.2 TMZ上調(diào)U251 細(xì)胞TNFAIP1 的表達(dá)

為確定TMZ 是否會影響U251 細(xì)胞內(nèi)TNFAIP1的表達(dá)，本試驗分別用0.1、0.2、0.3 mmol/L 的TMZ處理U251 細(xì)胞36 h，然后分別提取總RNA 和總蛋白。半定量PCR 試驗結(jié)果表明，隨著TMZ 濃度的升高，TNFAIP1 的mRNA 表達(dá)上調(diào)，如圖2b 所示。Western blot 試驗進(jìn)一步表明，隨著TMZ 濃度的升高，TNFAIP1 的蛋白表達(dá)量上調(diào)，如圖2a 所示。這說明用TMZ 處理U251 之后上調(diào)了內(nèi)源TNFAIP1 的表達(dá)。

2.3 過表達(dá)TNFAIP1促進(jìn)TMZ對U251細(xì)胞遷移與侵襲的抑制作用

為了探討TNFAIP1 是否參與TMZ 對U251 遷移與侵襲的抑制，本試驗把轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pCMVMyc 組設(shè)為對照組，把過表達(dá)TNFAIP1 組（Myc-TNFAIP1）、添加TMZ 0.3 mmol/L組（pCMV-Myc＋TMZ 0.3 mmol/L）、TMZ 0.3 mmol/L ＋過表達(dá)TNFAIP1 組（Myc-TNFAIP1＋TMZ 0.3 mmol/L）設(shè)為試驗組。過表達(dá)TNFAIP1 及0.3 mmol/L TMZ 單獨處理均可抑制U251 的遷移與侵襲，但TMZ 0.3 mmol/L ＋過表達(dá)TNFAIP1 聯(lián)合作用對U251 遷移與侵襲的抑制顯著大于過表達(dá)TNFAIP1和0.3 mmol/L TMZ單獨處理組，如圖3a～3d所示。這說明TNFAIP1可促進(jìn)TMZ對腦膠質(zhì)瘤的殺傷作用。

圖1 不同濃度TMZ 對U251 細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響Fig. 1 Cell migration and invasion levels in U251 cells exposed to different concentration of TMZ

圖2 不同濃度的TMZ 對TNFAIP1表達(dá)影響的分析Fig. 2 TNFAIP1 expression in U251 cells exposed to different concentration of TMZ

2.4 TNFAIP1 通過EMT 通路抑制U251 細(xì)胞的遷移與侵襲

試驗最后研究了TNFAIP1 是否通過EMT 通路抑制U251 細(xì)胞的遷移與侵襲。當(dāng)在U251 細(xì)胞中過表達(dá)TNFAIP1 和用0.3 mmol/L 的TMZ 單獨處理時，與對照組相比，上皮分子標(biāo)志物E-cadherin 的表達(dá)分別上調(diào)37.1%、31.6%（P＜0.01）；間質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)記物N-cadherin分別下調(diào)20.7%、33.7%（P＜0.01）；Vimentin 分別下調(diào)4.5%（P＜0.05）、34.6%（P＜0.01）；Snail 分別下調(diào)3.5%（P＜0.05）、19.3%（P＜0.01）。而在過表達(dá)TNFAIP1 及添加0.3 mmol/L TMZ 聯(lián)合作用組中，上皮分子標(biāo)記物E-cadherin 的蛋白表達(dá)比較于對照組上調(diào)46.4%（P＜0.01），間充質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)記物N-cadherin、Vimentin、Snail 的表達(dá)則分別下調(diào)44.3%、52.9%、33.4%（P＜0.01），具體如圖4a～4c所示。這表明TNFAIP1 能通過EMT 通路參與TMZ對U251 細(xì)胞遷移與侵襲的抑制作用，從而減緩腫瘤惡化的發(fā)展速度。

圖3 過表達(dá)TNFAIP1促進(jìn)TMZ 對U251細(xì)胞遷移和侵襲的抑制Fig. 3 Changes in the effects of TMZ on U251 migration and invasion before and after TNFAIP1 overexpression

圖4 Western blot檢測過表達(dá)TNFAIP1對EMT信號通路的影響Fig. 4 Effect of TNFAIP1 over-expression on EMT signaling pathway detected by Western blot

3 討論

人腦膠質(zhì)瘤，特別是級別高的人腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后通常很差，傳統(tǒng)治療方法已無法有效提高其治愈率和存活率。目前治療方案主要是以手術(shù)治療為主，術(shù)后輔助放療和化療，其常用化療藥物為TMZ。TMZ 雖然目前被認(rèn)為是在開發(fā)新的臨床神經(jīng)膠質(zhì)瘤靶向藥物之前最為有效的治療劑，但是用其治療后的高復(fù)發(fā)率及患者預(yù)后不良等局限性仍不容小覷。人腦膠質(zhì)瘤的化療耐藥是一個復(fù)雜的過程，必須從多因素、多基因、多機制中共同探討其潛在的耐藥機制［20-22］。TNFAIP1 在人類、小鼠、大鼠和線蟲中都有一個極其進(jìn)化保守的單拷貝基因，且其在DNA 合成和細(xì)胞凋亡過程中的重要作用、在AD 尸檢患者的大腦中的上調(diào)表達(dá)、異常表達(dá)對小鼠來源神經(jīng)瘤母細(xì)胞（mouse neuroblastoma N2a cells，N2A）的影響等報導(dǎo)比比皆是［23-28］，證明了其在神經(jīng)性膠質(zhì)瘤中可能存在重要作用。但TNFAIP1在人腦膠質(zhì)瘤的TMZ耐藥性中的作用卻尚無報導(dǎo)。

為了探索TNFAIP1 是否在TMZ 抑制人腦膠質(zhì)瘤遷移及侵襲過程中存在作用，本試驗用TMZ對U251 細(xì)胞進(jìn)行藥物處理。與已發(fā)表的研究相似，TMZ 具有以劑量依賴的方式抑制U251 細(xì)胞的遷移和侵襲的能力［1，5，20］。之后，我們提取藥物處理U251 細(xì)胞后的總RNA 及總蛋白，分析發(fā)現(xiàn)TNFAIP1 的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。這表明TNFAIP1 可能參與了TMZ 對U251 細(xì)胞遷移及侵襲抑制的過程。此前我們實驗室已經(jīng)證明TNFAIP1是一個抑癌基因［18-19，26，28］，而TMZ 上調(diào)U251細(xì)胞中TNFAIP1 的表達(dá)，所以我們選擇過表達(dá)TNFAIP1。試驗數(shù)據(jù)表明，相較于只用TMZ和只過表達(dá)TNFAIP1，過表達(dá)TNFAIP1 聯(lián)合TMZ 對U251 細(xì)胞遷移及侵襲的抑制作用明顯增強。這說明過表達(dá)TNFAIP1 能聯(lián)合TMZ 促進(jìn)對人腦膠質(zhì)瘤遷移和侵襲的抑制作用。

臨床上認(rèn)為癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是腫瘤不良預(yù)后的主要原因，大量文獻(xiàn)報導(dǎo)，EMT 是腫瘤細(xì)胞獲得強侵襲及轉(zhuǎn)移能力的重要進(jìn)程之一。EMT 是上皮細(xì)胞失去極性而重組細(xì)胞骨架，進(jìn)而轉(zhuǎn)變成具有遷移能力的間質(zhì)表型的過程。該過程與多種上皮和間充質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄水平改變有關(guān)。且有研究表明，化療藥物常抑制EMT 的進(jìn)展［29-32］。EMT 也被認(rèn)為是卵巢癌、肝癌等腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的中心機制［33-34］。EMT 中上皮分子標(biāo)志物E-cadherin 的下調(diào)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，已有研究發(fā)現(xiàn)了一些能夠抑制E-cadherin 表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，包括Snail、Slug、Twist 及E47蛋白［35］。且EMT 中間充質(zhì)標(biāo)志物蛋白的表達(dá)增加能使上皮細(xì)胞表現(xiàn)出多種間充質(zhì)細(xì)胞的特質(zhì)，從而導(dǎo)致細(xì)胞的運動能力和侵襲性增加［33，36］。試驗數(shù)據(jù)表明，相較于只用TMZ 和只過表達(dá)TNFAIP1，過表達(dá)TNFAIP1 聯(lián)合TMZ 使EMT 的過程受到抑制，表現(xiàn)為上皮分子標(biāo)志物E-cadherin 表達(dá)上調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)記物N-cadherin、Vimentin 和Snail 表達(dá)下調(diào)，這表明TNFAIP1 能通過EMT 通路抑制U251 細(xì)胞的遷移與侵襲。

綜上所述，我們的研究說明TMZ 不僅能抑制U251 的遷移與侵襲能力，同時能升高TNFAIP1 的表達(dá)。過表達(dá)TNFAIP1 可以促進(jìn)TMZ 對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 遷移與侵襲的抑制，表明TNFAIP1作為一個抑癌基因在TMZ 抑制U251 遷移、侵襲過程中發(fā)揮了重要作用，因此TNFAIP1 可以作為臨床治療人腦膠質(zhì)瘤耐藥的潛在生物標(biāo)志物和潛在的藥物靶點。但TNFAIP1 參與U251 對TMZ 耐藥的具體過程及分子機制仍需進(jìn)行更深入的研究。