陳汝斌，彭沙莎，王 丹*，康厚祥

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙 410128；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所/植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193）

水稻（Oryzae sativaL.）是世界上最重要的糧食作物之一，養(yǎng)育了世界近一半以上的人口［1］。據(jù)研究，到2050 年，平均每年需要增加44 萬t 以上的糧食產(chǎn)量以滿足全球的糧食需求［2］。由稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病是一種長期侵害水稻的真菌病害，幾乎發(fā)生在水稻生長發(fā)育的整個時期［3］。根據(jù)侵染部位可將其分為苗瘟、葉瘟、穗頸瘟、節(jié)瘟以及谷粒瘟等類型［4］。每年因稻瘟病造成的水稻收成損失可達到10%～30%，嚴(yán)重時達50%以上，甚至顆粒無收，給我國的糧食生產(chǎn)及稻米品質(zhì)造成了嚴(yán)重的損失。目前針對稻瘟病發(fā)生的防止措施是化學(xué)藥劑防治以及培育優(yōu)良廣譜抗性品種。相比于前者，后者具有經(jīng)濟、環(huán)保、高效等特點［5］。然而，由于田間稻瘟菌生理小種基數(shù)大、傳播和變異速度快等原因，已有抗病基因的水稻其抗性在推廣3～5 年后容易喪失，因此快速挖掘新的稻瘟病抗性基因?qū)ε嘤沟疚敛∑贩N具有重大的意義［6］。

目前，定位復(fù)雜性狀主要有兩種方式，一是經(jīng)典的連鎖分析，二是關(guān)聯(lián)分析。連鎖分析基于雙親雜交構(gòu)建遺傳作圖群體，通過遺傳標(biāo)記對個體進行基因分型，并對結(jié)果進行分析。但該方法存在構(gòu)建群體耗費時間長且每個位點只能鑒定2 個等位基因等缺點，因此所鑒定數(shù)量性狀位點（quantitative trait locus，QTL）的數(shù)量受到限制［7］。而關(guān)聯(lián)分析相較于連鎖分析有以下幾個優(yōu)點：1）目標(biāo)群體為自然群體，不需要耗費大量時間構(gòu)建雙親作圖群體，極大地節(jié)約了時間和降低了工作強度；2）可同時鑒定多個等位基因。全基因組測序技術(shù)的不斷發(fā)展推動了全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）技術(shù)用于遺傳作圖的進程。GWAS 又名連鎖不平衡作圖，可快速對QTL 進行精細(xì)定位，且分析通量較高［8］。該方法在研究水稻的農(nóng)藝性狀改良中被廣泛應(yīng)用。如Lu 等［9］利用469 份水稻種質(zhì)資源定位了17 個水稻劍葉長度相關(guān)的QTL；Huang等［10］從950 份水稻品種中定位到10 個與產(chǎn)量性狀相關(guān)的QTL；Jiang 等［11］鑒定出350 份水稻品種中23 個與水稻分蘗相關(guān)的QTL。近幾年GWAS 也被應(yīng)用于定位抗病相關(guān)位點。如Zhang 等［12］用6 個白葉枯小種對172 份群體材料進行接種，通過GWAS鑒定了12 個白葉枯抗性相關(guān)位點；Kang 等［13］用5 個稻瘟菌接種了390 份群體材料，鑒定出97 個稻瘟病抗性相關(guān)位點；Liu 等［14］通過GWAS 鑒定了27 個稻瘟病抗性相關(guān)位點，并成功克隆了一個稻瘟病抗性基因PiPR1。GWAS 方法的廣泛應(yīng)用極大程度上提高了育種的效率及精度，為后續(xù)抗性品種選育提供了一定的科學(xué)基礎(chǔ)。

為進一步發(fā)掘新的稻瘟病抗性基因，本研究對水稻多樣性群體II（rice diversity group II，RDP-II）中470 份水稻種質(zhì)資源進行了稻瘟病抗性評估，并使用高密度陣列［700 000 個單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）］進行了基因分型［15］，選擇最優(yōu)的關(guān)聯(lián)分析模型，并對定位的稻瘟病抗性相關(guān)的QTL 進行了分析，為快速發(fā)掘新的稻瘟病抗性基因提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與田間種植

本研究所用的470 份水稻材料來自RDP-II，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院劉斌老師提供。于2018 年5 月將育好的秧苗種植于湖南省益陽市桃江縣的自然病圃中（N28°22'，E112°03'），以每行20 株種植24 行，株行距為15 cm×24 cm。該病圃面積約0.133 km2，歷年來稻瘟病發(fā)生較為嚴(yán)重。此外，為保證發(fā)病質(zhì)量，本研究在群體材料周圍種植了高感稻瘟病的品種進行自然誘發(fā)。在生長階段應(yīng)注意水培管理，多施加氮肥以誘導(dǎo)稻瘟病的發(fā)生，待水稻苗三葉一心時期（2018年6月）進行葉瘟調(diào)查。

1.2 表型調(diào)查及分析

根據(jù)稻瘟病分級標(biāo)準(zhǔn)對自然病圃中群體材料進行調(diào)查［13］，其中0 級（高抗）為無病斑；1 級（高抗）為僅有針尖大小病斑；2 級（抗）為出現(xiàn)較大褐點；3 級（中抗）為直徑1～2 mm 的小圓斑；4～6 級（中感）開始形成典型的病斑，占葉面積大小約6%～25%；7 級（感）的病斑面積超過25%；8～9 級（高感）的病斑面積達到50%以上，甚至整片葉片死亡。利用Excel 2010 進行表型數(shù)據(jù)的處理，過濾掉不正常數(shù)據(jù)后，以2 次重復(fù)數(shù)據(jù)的平均值對亞群表型及抗性品種分布等結(jié)果進行分析。

1.3 基因型檢測與分析

利用Mccouch 等［15］報道的700 000 個SNP 芯片對470 份水稻種質(zhì)資源進行基因型分析，在Tassel 4.0 軟件中過濾掉低質(zhì)量的SNP 位點，選擇最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞0.05 以及缺失率≥20%的SNP 位點，以進行下一步的關(guān)聯(lián)分析。

1.4 GWAS 數(shù)據(jù)分析

本研究利用700 000 個SNP 基因型數(shù)據(jù)以及來自RDP-II 群體的470 份水稻材料的抗病表型數(shù)據(jù)，選擇混合線性模型（mixed linear model，MLM），即同時加入親緣關(guān)系Kinship 以及群體結(jié)構(gòu)Q 矩陣，在Tassel 4.0軟件中進行GWAS。利用R軟件（R version 3.6.2）的qqman包繪制曼哈頓圖。

1.5 抗病相關(guān)QTL的定位

通過GWAS，我們得到176 個與稻瘟病抗性相關(guān)聯(lián)的SNP［-log10（Pvalue）≥3.50］。為了降低假陽性，我們以在200 kb 的基因組間隔內(nèi)具有至少2 個顯著相關(guān)的SNP 位點為標(biāo)準(zhǔn)定位抗病相關(guān)的QTL。在國家水稻數(shù)據(jù)中心（http://www.ricedata.cn/）及NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中尋找已克隆或定位的稻瘟病抗性相關(guān)基因的位置信息，與本研究所檢測的QTL進行共定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然群體抗病表型分析

本研究根據(jù)國際水稻所稻瘟病0～9 級分級標(biāo)準(zhǔn)，對湖南省桃江縣自然病圃中（圖1）的470 份水稻品種進行了稻瘟病抗性的評估，其中0～1 級為高抗、2 級為抗、3 級為中抗、4～6 級為中感、7 級為感、8～9級為高感。

抗病表型的統(tǒng)計結(jié)果如表1 所示?？共∑贩N占自然群體的32.98%，而感病品種占自然群體67.02%，表明該群體總體趨勢上對稻瘟菌表現(xiàn)為感病。

圖1 湖南省桃江縣稻瘟病自然病圃Fig. 1 Natural blast nursery in Taojiang county, Hunan province

表1 RDP-II群體中抗病表型分布Tab. 1 The distribution of resistance phenotype in RDP-II population

2.2 群體中亞群抗病表型分析

本研究所用群體材料除6 份未定義品種外，可大致分為6 個亞群，其中秈稻（indica，IND）163 份、香型稻（aromatic，ARO）65份、熱帶粳稻（tropical ja-ponica，TRJ）102份、溫帶粳稻（temperate japonica，TEJ）35份、混合型水稻（admixture，ADM）28份，奧斯稻（aus，AUS）71 份。從亞群抗病表型直方圖中（圖2a）我們發(fā)現(xiàn)，熱帶粳稻亞群的平均抗性水平最高，達到4.0，而溫帶粳稻亞群的平均抗性水平最低，達到6.0，秈稻亞群的平均抗性水平居中，為5.3。氣泡圖如圖2b 所示。氣泡自上而下分別代表1～9 抗病等級，氣泡大小代表品種數(shù)目。通過分析發(fā)現(xiàn)，在抗病等級≤3（表型表現(xiàn)為抗病）時，熱帶粳稻亞群中含有56個符合條件的品種，而溫帶粳稻亞群僅含有8個品種。該結(jié)果進一步證明了以上結(jié)論。

圖2 RDP-II群體的亞群抗病表型Fig. 2 Subpopulations resistance phenotype of RDP-II

通過對470 份水稻群體材料的表型數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，在73份抗性品種（0～2級）中，熱帶粳稻亞群的品種最多，占總數(shù)的38%，而溫帶粳稻亞群的品種僅占6%。該結(jié)果同群體材料中亞群稻瘟病抗性分布較為一致。此外，表2 特別列出了超高抗的25 個品種（0～1 級），其分別來自亞洲（56%）、非洲（24%）、北美洲（16%）以及歐洲（4%）這4個不同的大洲。這些超高抗材料為抗病育種提供了優(yōu)良的種質(zhì)資源。

表2 高抗品種亞群及地區(qū)分布Tab. 2 Subpopulation and regional distribution of high resistant varieties

2.3 GWAS

本研究基于470 份水稻自然群體材料的抗病表型數(shù)據(jù)以及700 000 個SNP 基因型數(shù)據(jù), 選擇MLM模型進行抗病表型數(shù)據(jù)和SNP 標(biāo)記的GWAS。在閾值［-log10（Pvalue）≥3.50］時判定SNP 標(biāo)記與抗病表型關(guān)聯(lián)的顯著性，共檢測到176 個相關(guān)聯(lián)的SNP位點，覆蓋于全部染色體。抗病表型關(guān)聯(lián)分析結(jié)果如圖3 所示，曼哈頓圖中紅色虛線以上代表抗病相關(guān)性顯著的位點。

2.4 稻瘟病抗性關(guān)聯(lián)位點鑒定

以SNP 上下游200 kb 范圍內(nèi)至少2 個顯著相關(guān)SNP 位點作為1 個QTL，對GWAS 結(jié)果所檢測的176 個抗病相關(guān)SNP 進行QTL 分析。由表3 可知，在除了4 號及7 號外的10 條染色體上定位到24 個稻瘟病抗性相關(guān)位點（loci associated with rice blast resistance，LABRs）。6 號染色體上分布最多，為4 個，其中最關(guān)聯(lián)的SNP 標(biāo)記（SNP-6.8792603）也位于6 號染色體上。將這些檢測的LABRs 同已克隆或定位的稻瘟病抗性相關(guān)基因進行共定位，結(jié)果共定位到4 個已克隆稻瘟病抗性基因和2 個已定位的基因，分別是1 號染色體的OsSGT1［16］、2 號染色體的OsCBSX3［17］和OsCUL3a［18］、11 號染色體的Pi-38［19］、12 號染色體的Pi-ta［20］和Pi-42［21］。分析發(fā)現(xiàn)，這4 個基因中除了OsCUL3a為負(fù)調(diào)控因子外，其余均為抗病反應(yīng)的正調(diào)控因子。

圖3 稻瘟病抗病表型全基因組關(guān)聯(lián)分析曼哈頓圖Fig. 3 Genome-wide association analysis manhattan plots of rice blast resistance

3 討論

稻瘟病抗性機制復(fù)雜，既受主效基因的控制，又受QTL 的影響。由主效基因介導(dǎo)的抗性是定性的，對稻瘟菌具有完全的抗性，而由多個QTL 介導(dǎo)的抗性是定量的，對稻瘟菌只表現(xiàn)部分抗性［22］。廣泛的實踐證明，單一主效抗性基因在3～5年內(nèi)易失去抗性［23］，因此快速挖掘新的稻瘟病抗性基因意義重大。本研究對470 份水稻種質(zhì)資源進行了水稻苗期稻瘟病抗性評估，其中熱帶粳稻亞群的平均抗性水平最高，而溫帶粳稻亞群的平均抗性水平最低，秈稻亞群的平均抗性水平居中。該結(jié)論與之前對RDP-I 和RDP-II 群體的表型研究結(jié)果一致［13-14］。同時對高抗品種的亞群分布進行研究，發(fā)現(xiàn)來自熱帶粳稻亞群最多，這與群體分布結(jié)果相一致。此外，高抗品種中一半以上來自亞洲（56%），可能與亞洲地區(qū)的稻瘟病抗性選擇較高有關(guān)。本研究所獲得的高抗品種為育種家提供了新的抗稻瘟病種質(zhì)資源。

本研究選擇混合線性模型MLM 對抗病表型數(shù)據(jù)及700 000 個SNP 基因型數(shù)據(jù)進行GWAS，共檢測到分布于12 條染色體上的176 個相關(guān)聯(lián)SNP位點。通過對這些SNP 位點進行QTL 分析發(fā)現(xiàn)，在除了4 號及7 號外的10 條染色體上定位到24 個LABRs，-log10（Pvalue）值介于3.72～5.10 之間，可以解釋3.37%～45.06%的表型變異。將這些LABRs同已克隆或定位的基因進行共定位，分析發(fā)現(xiàn)，5 個位點（LABR2、LABR4、LABR6、LABR22、LABR23）共定位了6 個稻瘟病抗性相關(guān)基因，包括4 個已克隆及2 個已定位的基因，分別位于1、2、11 及12 號染色體上。這5 個位點對應(yīng)的峰值SNP 分別為SNP-1.25004091、SNP-2.3910977、SNP-2.31170935、SNP-11.21704502、SNP-12.10723430。除上述5 個位點與已報道的位點共定位外，其余19 個顯著關(guān)聯(lián)位點為首次發(fā)現(xiàn)。這些新位點的發(fā)現(xiàn)對后續(xù)稻瘟病抗性基因的發(fā)掘以及進一步的優(yōu)良品種選育工作具有重要意義?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，下一步的研究工作將主要集中于候選基因的選擇以及稻瘟病抗性基因的克隆與功能驗證，為培育廣譜抗性水稻品種提供理論基礎(chǔ)。

表3 24個稻瘟病抗性顯著相關(guān)位點Tab. 3 24 significant LABRs