胡駿杰，劉 飛，馬文俊，上官國強*

(1.濟寧醫(yī)學(xué)院 司法鑒定中心，山東 濟寧 272067；2.濟寧醫(yī)學(xué)院 法醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，山東 濟寧 272067；3.南京大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，生命分析化學(xué)國家重點實驗室，江蘇 南京 210023)

苯二氮卓類藥物(Benzodiazepines,BZDs)是一類中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物，具有鎮(zhèn)靜、安眠、抗焦慮、抗驚厥等功效[1-2]，因其療效好、毒性小，近年來已成為臨床應(yīng)用最為廣泛的安眠鎮(zhèn)靜藥物[3]。根據(jù)半衰期長短，苯二氮卓類藥物可分為3類：短效類(咪達唑侖等)、中效類(勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖等)及長效類(地西泮、硝西泮、氟硝西泮、氯硝西泮等)。然而，作為一類受到嚴格管控的精神類藥物，苯二氮卓類藥物的過量使用、長期使用或多種藥物混用均會引起中毒，導(dǎo)致昏迷、血壓下降、呼吸循環(huán)抑制甚至死亡[4]。據(jù)文獻報道，臨床上濫用該類藥物自殺的病例較常見[5]；近年來也被犯罪分子用于麻醉搶劫、強奸，導(dǎo)致被害人藥物中毒、身心受到殘害[6]。因此，建立準確、簡便的苯二氮卓類藥物分析方法，迅速判斷中毒藥物，并通過血藥濃度評估病情，對患者病情的確診極其重要。

血液中苯二氮卓類藥物的檢測方法主要包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[7-9]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[10-13]，相較而言，LC-MS/MS法具有更高的分析通量及更強的定量檢測能力[7-8]。相關(guān)標(biāo)準方法中[14]，血液樣品的前處理使用有機溶劑液液萃取法，實驗操作步驟繁瑣；且LC-MS/MS分析中僅采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，痕量物質(zhì)確證困難?；诖耍狙芯繉ρ簶悠返那疤幚聿襟E進行了簡化；并借助三重四極桿-線性離子阱(QTRAP)復(fù)合型質(zhì)譜系統(tǒng)的優(yōu)勢[15-16]，選取臨床中具有代表性的8種不同類別的常用苯二氮卓類藥物作為研究對象，建立了高效液相色譜-三重四極桿復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜(QTRAP HPLC-MS/MS)檢測方法，采用分段多反應(yīng)監(jiān)測-信息依賴性采集-增強離子掃描(sMRM-IDA-EPI)模式分析，結(jié)合EPI二級譜庫檢索對血液樣本中8種苯二氮卓類藥物進行確證，依據(jù)sMRM數(shù)據(jù)進行外標(biāo)法定量分析。該方法操作簡便，結(jié)果可靠，可為拯救生命贏得寶貴時間，同時也為急救醫(yī)療、中毒檢測等領(lǐng)域提供技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

SCIEX QTRAP?5500超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)；5804R型高速離心機(德國艾本德股份公司)。

地西泮、硝西泮、氯硝西泮、氟硝西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、咪達唑侖標(biāo)準品(美國Cerilliant標(biāo)準物質(zhì)公司，均為1.000 mg/mL甲醇溶液)；乙酸銨(質(zhì)譜級，美國Fluka公司)、甲酸、甲醇及乙腈(色譜純，德國Merck公司)；實驗用水為超純水。空白血液由健康志愿者提供，置于-20 ℃冰箱密封保存。

1.2 標(biāo)準溶液的配制

以移液器分別移取10 μL質(zhì)量濃度為1.000 mg/mL的地西泮等8種苯二氮卓類藥物標(biāo)準品至10 mL容量瓶中，以甲醇定容，配制質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL的混合標(biāo)準儲備液，置于-20 ℃冰箱保存，有效期為6個月。

準確吸取一定體積的上述混合標(biāo)準儲備液于10 mL容量瓶中，以甲醇定容，配制質(zhì)量濃度分別為5.0、10、20、50、100、200、500 ng/mL的混合標(biāo)準工作液，置于4 ℃冰箱保存，有效期為7 d。

1.3 血樣前處理

有機溶劑液液萃取法：精密吸取500 μL血樣置于離心管中，加入1.0 mL硼酸緩沖液(pH 9.2)，用2.0 mL乙醚提取，渦旋混勻后，以10 000 r/min離心5 min。上清液于60 ℃水浴揮干，殘余物以500 μL甲醇復(fù)溶，過0.22 μm有機相濾膜后，進行HPLC-MS/MS分析。

甲醇沉淀蛋白法：精密吸取500 μL血樣置于離心管中，加入1.0 mL甲醇，渦旋混勻，以10 000 r/min離心5 min，吸取上清液，過0.22 μm有機相濾膜后，進行HPLC-MS/MS分析。

乙腈沉淀蛋白法：精密吸取500 μL血樣置于離心管中，加入1.0 mL乙腈，渦旋混勻，以10 000 r/min離心5 min，吸取上清液，過0.22 μm有機相濾膜后，進行HPLC-MS/MS分析。

1.4 實驗條件

色譜條件：Phenomenex Kinetex?Biphenyl(100 mm×3.0 mm,2.6 μm)色譜柱；流動相：A為5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液；B為甲醇；流速：0.5 mL/min；進樣量：2 μL；柱溫：40 ℃；梯度洗脫程序：0～1.0 min,5%B；1.0～1.5 min,5%～20%B;1.5～9.0 min,20%～95%B;9.0～11.0 min,95%B；11.0～11.1 min,95%～5%B;11.1～14.0 min,5%B。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧源(ESI+)；掃描方式：sMRM-IDA-EPI；離子源電壓(IS)：5 500 V；離子源溫度：500 ℃。8種苯二氮卓類藥物的MRM參數(shù)及色譜保留時間見表1。

表1 8種苯二氮卓類藥物的MS/MS采集參數(shù)及保留時間Table 1 MS/MS acquisition parameters and retention times of 8 benzodiazepines

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜掃描模式的選擇

本研究基于高效液相色譜-三重四極桿復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜技術(shù)，采用sMRM-IDA-EPI掃描模式，實現(xiàn)血液樣本中8種苯二氮卓類藥物的快速確證與定量分析。將分段掃描模式Scheduled MRM檢測窗口時間設(shè)為60 s，可在保留時間附近鎖定并捕捉目標(biāo)物信號，提高色譜峰的響應(yīng)值；sMRM作為IDA預(yù)掃描，還可觸發(fā)EPI掃描。相比于單純?nèi)厮臉O桿質(zhì)譜，QTRAP復(fù)合型質(zhì)譜可使二級碎片在離子阱中富集，以獲取目標(biāo)化合物高靈敏的二級質(zhì)譜信息，通過進一步與所建EPI譜庫檢索匹配，可迅速確證檢出物，顯著提高定性分析結(jié)果的可信度。

2.2 EPI譜庫的構(gòu)建與檢索

分別在低(20 eV)、中(35 eV)、高(50 eV)3種碰撞能量下，對8種苯二氮卓類藥物標(biāo)準品進行EPI掃描，構(gòu)建EPI二級譜庫，并記錄目標(biāo)化合物的離子碎片特征信息。實際血樣采用sMRM-IDA-EPI模式掃描并獲取檢出物的EPI二級譜圖，進行EPI譜庫檢索匹配，以比對結(jié)果中的匹配度值(Fit值)。Fit值反映檢出可疑物質(zhì)與標(biāo)準物質(zhì)譜圖的相似度，其值越高，則匹配度越高。

2.3 液相色譜條件的優(yōu)化

2.3.1 色譜柱的選擇考察了Phenomenex Kinetex?Biphenyl(100 mm×3.0 mm,2.6 μm)與Venusil MP C18(100 mm×2.1 mm，3 μm)兩種不同固定相官能團的色譜柱對8種目標(biāo)化合物的分離效果。結(jié)果表明，由于苯二氮卓類藥物具有苯環(huán)與含氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)，基于π-π相互作用與疏水相互作用雙重作用力，其在Biphenyl(雙苯基)柱上的保留、分離效果和色譜峰形均優(yōu)于C18色譜柱，因此實驗采用Biphenyl色譜柱(100 mm×3.0 mm,2.6 μm)分析目標(biāo)化合物。

2.3.2 流動相的選擇以0.1%甲酸水溶液作為水相，實驗考察了分別以甲醇與乙腈作為有機相時對8種苯二氮卓類藥物分離效果的影響。結(jié)果顯示，在“1.4”所述梯度洗脫程序下，甲醇作為有機相時8種目標(biāo)化合物的分離效果更好。因此以甲醇為有機相，進一步考察了0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸水溶液-5 mmol/L乙酸銨對分離效果的影響，結(jié)果表明，水相中含乙酸銨時，目標(biāo)分析物的峰形得到明顯改善，其峰寬更窄(均在15 s內(nèi))，且峰形更對稱?；谝陨辖Y(jié)果，確定采用甲醇與0.1%甲酸水溶液-5 mmol/L乙酸銨作為流動相。在優(yōu)化條件下，8種苯二氮卓類藥物空白血液基質(zhì)加標(biāo)溶液的提取離子流色譜圖見圖1，各化合物的保留時間見表1。雖然部分化合物的提取離子色譜峰重疊，但液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)主要以目標(biāo)物特征離子對的豐度比及峰面積作為定性、定量依據(jù)，具有高度專屬性，因此分離度對苯二氮卓類藥物的定性及定量分析結(jié)果不會造成影響。此外，本實驗采用全梯度洗脫，優(yōu)化后的液相色譜條件可擴展應(yīng)用于更多類型毒物的篩查，且可保證分析靈敏度和準確性，具有很好的適用性和較高的分析效率。

圖1 空白血液基質(zhì)添加8種苯二氮卓類藥物(10 ng/mL)的提取離子流色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatogram of 8 benzodiazepines(10 ng/mL) spiked in blank blood matrix

2.4 血樣前處理方法的優(yōu)化

實驗考察了有機溶劑液液萃取法、甲醇沉淀蛋白法和乙腈沉淀蛋白法對低(1.0 ng/mL)、中(5.0 ng/mL)、高(20 ng/mL)質(zhì)量濃度混合標(biāo)準加標(biāo)血樣中目標(biāo)分析物的提取效果，8種苯二氮卓類藥物的平均回收率范圍見表2。結(jié)果顯示，有機溶劑液液萃取法和乙腈沉淀蛋白法對血樣中蛋白質(zhì)等復(fù)雜成分的凈化效果優(yōu)于甲醇沉淀蛋白法，目標(biāo)分析物具有較高的回收率。相比于有機溶劑液液萃取法，乙腈沉淀蛋白法的操作更快捷簡便，因而選取該方法處理血液樣品。

表2 不同前處理方法下血樣中8種苯二氮卓類藥物的平均回收率(n=6)Table 2 Average recoveries of 8 benzodiazepines in blood samples with different pre-treatment methods(n=6)

2.5 方法性能指標(biāo)

2.5.1 線性方程、檢出限與定量下限吸取450 μL空白血液與50 μL系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準工作液，渦旋混勻，分別制成含8種苯二氮卓類藥物質(zhì)量濃度為0.5～50 ng/mL的標(biāo)準血樣，按“1.3”所述乙腈沉淀蛋白法處理血樣，并進行HPLC-MS/MS分析。分別以8種苯二氮卓類藥物定量離子對的峰面積(y)對其質(zhì)量濃度(x,ng/mL)作圖并進行線性回歸分析，結(jié)果顯示，各化合物在0.5～50 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.998。取0.5 ng/mL的上述標(biāo)準血樣逐級稀釋，采用本方法進行測定，得到8種苯二氮卓類藥物的檢出限(LOD,S/N≥3)為0.01～0.10 ng/mL，定量下限(LOQ,S/N≥10)為0.10～0.25 ng/mL(表3)。

表3 8種苯二氮卓類藥物在血液中的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限Table 3 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients,limits of detection and limits of quantitation of 8 benzodiazepines in blood

2.5.2 回收率、基質(zhì)效應(yīng)與相對標(biāo)準偏差分別在空白血樣中添加低、中、高濃度的混合標(biāo)準工作液，配制成8種苯二氮卓類藥物質(zhì)量濃度分別為1.0、5.0、20 ng/mL的加標(biāo)血樣，各濃度設(shè)置6個平行，按本方法進行測定，并以提取加標(biāo)血樣與相應(yīng)濃度混合標(biāo)準溶液中對應(yīng)化合物的定量離子對峰面積之比計算基質(zhì)效應(yīng)。如表4所示，8種苯二氮卓類藥物在血液中的基質(zhì)效應(yīng)為79.8%～97.2%，說明基質(zhì)對實驗結(jié)果影響不大，本方法采用基質(zhì)匹配溶液定量以進一步減小誤差;各物質(zhì)的回收率為79.3%～112%，相對標(biāo)準偏差(RSD)為4.3%～11%。

表4 8種苯二氮卓類藥物在血液中的基質(zhì)效應(yīng)、平均回收率與相對標(biāo)準偏差(n=6)Table 4 Matrix effects,average recoveries and relative standard deviations(RSD) of 8 benzodiazepines in blood(n=6)

2.6 實際樣本檢測

2020年11月，某醫(yī)院送檢急診疑似苯二氮卓類藥物中毒患者的血液樣本1份。采用本方法篩查血液樣本并進行HPLC-MS/MS分析，獲取MRM譜圖及EPI二級譜圖。結(jié)果顯示，該樣本中檢出可疑物質(zhì)地西泮、阿普唑侖及咪達唑侖，各物質(zhì)的提取離子流色譜圖見圖2；進一步將樣品EPI譜圖在構(gòu)建譜庫中檢索匹配，顯示檢出物質(zhì)與地西泮、阿普唑侖及咪達唑侖的標(biāo)準譜圖具有高度一致性，匹配值分別為93.52、94.66及91.87。因此，判斷該樣本中檢出地西泮、阿普唑侖及咪達唑侖。利用原樣本及稀釋20倍后進樣的MRM數(shù)據(jù)進行定量分析，檢出地西泮、阿普唑侖及咪達唑侖的質(zhì)量濃度分別為30.57、6.51、686.9 ng/mL。

圖2 血液樣本中3種可疑檢出物的提取離子流色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatograms of the suspicious detected compounds in blood sample

3 結(jié) 論

對于苯二氮卓類藥物的HPLC-MS/MS分析，目前國際上多采取固相萃取[3,9]、液液萃取及QuEChERS等方法[4]處理生物樣品，并結(jié)合目標(biāo)分析物的氘代同位素內(nèi)標(biāo)實現(xiàn)定量分析[3-4,8-9,11]。本研究基于超高效液相色譜-三重四極桿復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜技術(shù)，建立了血液樣本中8種苯二氮卓類藥物的快速確證與檢測方法。采用乙腈沉淀蛋白法處理血液樣本，相比于傳統(tǒng)有機溶劑液液萃取法，簡化了操作步驟，有效縮短了實驗時間；應(yīng)用sMRM-IDA-EPI掃描模式，結(jié)合譜庫檢索確證檢出物信息，增強了定性分析結(jié)果的可信度；以外標(biāo)法定量，結(jié)果直觀靈敏。雖然該方法在定量準確度方面可能有所欠缺，但實驗步驟簡便，實驗成本低，定性分析結(jié)果可信度高，特別適用于醫(yī)療搶救中可疑中毒樣本相關(guān)物質(zhì)的快速篩查及大致定量，輔助醫(yī)護急救人員對病情迅速確診及評估。此外，還可通過逐步完善EPI譜庫，將其推廣應(yīng)用至血液中更多種藥物毒物的快速確證及檢測，為醫(yī)療急救、臨床治療等提供技術(shù)支持。