癌旁組織二酯酰甘油激酶γ表達(dá)水平對(duì)肝癌患者術(shù)后生存的影響

錢(qián)相君，郭正陽(yáng)，王 莉，聶涵笑，賀 濤，王效謙，萬(wàn)百順，姚明解，張 玲

1 鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 肝膽胰外科，鄭州 450008； 2 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 a.病原生物學(xué)系暨感染病中心，b.人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系，北京 100191；3 北京大學(xué)第三醫(yī)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100191

肝細(xì)胞癌(HCC，簡(jiǎn)稱(chēng)肝癌)居我國(guó)最常見(jiàn)惡性腫瘤的第四位及腫瘤致死病因的第二位，嚴(yán)重威脅著人民的生命健康[1-3]，肝切除術(shù)是肝癌的主要治療方式之一[4]，雖然近年來(lái)肝癌的外科治療技術(shù)不斷發(fā)展，但患者的長(zhǎng)期預(yù)后并不十分理想[5-7]。因此，臨床上針對(duì)肝癌的多學(xué)科綜合治療受到越來(lái)越多的重視[5-6]。評(píng)估肝癌切除術(shù)后患者的預(yù)后并為其制訂科學(xué)合理的綜合治療方案對(duì)于改善術(shù)后生存至關(guān)重要，而目前這一過(guò)程的實(shí)現(xiàn)仍面臨著一些挑戰(zhàn)。

二酯酰甘油激酶(DGK)是使二脂酰甘油(DAG)磷酸化產(chǎn)生磷脂酸(PA)的一類(lèi)激酶；通過(guò)對(duì)DAG和PA作為第二信使所參與的體內(nèi)諸多生理信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，DGK在許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[8-10]。DGKγ是DGK家族的Ⅰ型成員之一，目前關(guān)于DGKγ在腫瘤中的作用研究比較有限。除了Kai等[11]報(bào)道的DGKγ在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌作用外，作者的前期研究[12]發(fā)現(xiàn)DGKγ在肝癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著腫瘤抑制因子的角色。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)相比于肝癌組織中DGKγ的低表達(dá)，癌旁組織中DGKγ的表達(dá)水平較高；且相比于肝癌組織中DGKγ高表達(dá)組的32.87個(gè)月的中位生存期，癌/癌旁組織中DGKγ非低表達(dá)組的中位生存期則為50.43個(gè)月[12]。這些結(jié)果提示了癌旁組織中DGKγ的表達(dá)水平可能對(duì)肝癌患者的預(yù)后也存在影響，但目前尚無(wú)對(duì)此的直接研究報(bào)道。本文通過(guò)相關(guān)的比較和生存分析，首次探究了肝癌患者癌旁組織中DGKγ的表達(dá)水平與肝癌術(shù)后預(yù)后的直接關(guān)系，并評(píng)估了其作為預(yù)后指標(biāo)的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2008年12月—2012年8月于鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院被診斷為肝癌并行手術(shù)切除術(shù)的患者82例；經(jīng)長(zhǎng)期隨訪最終入組的患者為78例，隨訪率為95.1%。78例患者均為伴有肝硬化的肝癌患者，其中男67例，女11例，平均(54.32±10.74)歲。納入的患者符合：肝腫瘤手術(shù)切除，術(shù)后病理證實(shí)為HCC；一般情況較好，肝功能Child分級(jí)為A級(jí)或B級(jí)；術(shù)前未進(jìn)行放化療。排除臨床資料不完整、合并有血液及免疫系統(tǒng)疾病及失訪的患者。長(zhǎng)期隨訪采用醫(yī)院就診和電話相結(jié)合的方式，第1年每3個(gè)月隨訪1次，隨后每6個(gè)月隨訪1次，最后隨訪日期為2018年7月1日。

1.2 臨床資料的采集 收集研究對(duì)象的年齡、性別等臨床基本信息；術(shù)前實(shí)驗(yàn)室檢查：HBsAg、AFP、ALT、AST、ALP、GGT、TBil、Alb、球蛋白(Glb)、RBC、PLT、PT、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)、纖維蛋白原(FIB)；以及術(shù)中輸血、腫瘤大小和數(shù)目、癌栓、切緣等資料。

1.3 癌旁組織中DGKγ的檢測(cè) 取手術(shù)切除腫瘤后距離腫瘤邊緣1～2 cm范圍的肝組織50 mg作為癌旁組織樣本，-80 ℃凍存保存，在研缽中加入適量的液氮充分研磨，之后收集至10 ml離心管中，加入1 ml TRIzol吹打混勻，室溫靜置5 min。然后提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后，以C末端結(jié)合蛋白1為內(nèi)參基因，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(SYBR Green I Master Mix, Roche)檢測(cè)癌旁組織中DGKγ mRNA的表達(dá)水平。

1.4 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：IRB00001052-12088，患者均知情同意。

2 結(jié)果

2.1 癌旁組織DGKγ 低表達(dá)組與高表達(dá)組的臨床資料比較 78例HCC患者癌旁DGKγ表達(dá)水平分別為0.079 5(0.007 0～1.697 5)。通過(guò)受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析78例HCC患者的癌旁DGKγ檢測(cè)值對(duì)患者長(zhǎng)期生存狀態(tài)的預(yù)測(cè)能力，曲線下面積(AUC)為0.733(P=0.001)，確定癌旁DGKγ的最佳截?cái)嘟缰禐?.086 2(圖1)。以0.086 2為界，將78例患者分為低表達(dá)組(DGKγ<0.086 2，簡(jiǎn)稱(chēng)LEP組,n=41)和高表達(dá)組(DGKγ≥0.086 2，簡(jiǎn)稱(chēng)HEP組,n=37)。

圖1 癌旁DGKγ預(yù)測(cè)患者生存狀態(tài)的ROC曲線

78例患者的臨床資料如表1所示，18例HBsAg陰性的患者中抗-HBc和抗-HCV陽(yáng)性的患者分別為4例和3例。比較肝癌患者癌旁組織DGKγ LEP組與HEP組的臨床資料，結(jié)果顯示：LEP組中的PT低于HEP組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而2組間的年齡、性別、HBsAg(陽(yáng)性/陰性)、術(shù)中輸血、BCLC分期、腫瘤大小和數(shù)目及其他的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表1)。

2.2 肝癌生存預(yù)后的單因素及多因素Cox回歸分析 單因素Cox分析結(jié)果顯示HBsAg、AFP、Alb、PLT、術(shù)中輸血、BCLC分期、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、切緣及癌旁組織DGKγ對(duì)肝癌患者術(shù)后OS的影響差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表2)。共線性診斷分析未發(fā)現(xiàn)單因素Cox分析有意義的指標(biāo)存在共線性；將這些指標(biāo)納入多因素Cox回歸模型，結(jié)果顯示癌旁DGKγ(HR=1.913，95%CI： 1.111～3.296，P=0.019)、HBsAg(HR=2.645，95%CI：1.264～5.537，P=0.010)、Alb(HR=0.952，95%CI：0.916～0.990，P=0.013)、BCLC分期(HR=1.702，95%CI：1.267～2.286，P<0.001)、腫瘤大小(HR=1.083，95%CI：1.019～1.152，P=0.011)是肝癌患者術(shù)后OS的獨(dú)立影響因素；其中癌旁組織DGKγ的高表達(dá)是危險(xiǎn)因素，HEP組的死亡風(fēng)險(xiǎn)是LEP組的1.913倍。

2.3 癌旁組織DGKγ LEP組與HEP組的生存曲線比較 基于以上結(jié)果，進(jìn)一步分析比較LEP組與HEP組的生存情況。在78例總患者中，LEP組和HEP組OS近期差異(Breslow檢驗(yàn))與遠(yuǎn)期差異(log-rank檢驗(yàn))均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，圖2a)，中位生存時(shí)間分別為45.0和22.9個(gè)月；LEP組與HEP組1、3、5年生存率分別為82.9%、56.1%、43.9%和64.9%、24.3%、13.5%。圖2b顯示出BCLC A期患者的OS要顯著優(yōu)于BCLC B期和C期的患者，中位生存時(shí)間分別為43.9、22.9和11.5個(gè)月。隨后，分別分析比較了在BCLC A期、BCLC B和C期中LEP組與HEP組的生存差異。結(jié)果顯示，對(duì)于BCLC A期的患者，LEP組和HEP組OS的遠(yuǎn)期差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2c)，中位生存時(shí)間分別為81.9和34.2個(gè)月；B期和C期患者中，LEP組和HEP組OS近期與遠(yuǎn)期差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05，圖2d)，但前者中位生存時(shí)間要高于后者，分別為16.5和10.8個(gè)月。

注：a、c、d分別為所有患者、BCLC A期、BCLC B和C期中的LEP組與HEP組生存曲線；b為BCLC各期患者的生存曲線。

3 討論

近年來(lái)，全世界及中國(guó)的肝癌發(fā)病和死亡人數(shù)仍然呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[5,7]。盡管隨著臨床圍手術(shù)期管理和診療技術(shù)的不斷進(jìn)步，對(duì)合并有肝硬化的肝癌患者的外科手術(shù)干預(yù)的短期風(fēng)險(xiǎn)大大降低，但整個(gè)肝癌患者人群的長(zhǎng)期預(yù)后仍不理想[1,5]。對(duì)術(shù)后患者進(jìn)行長(zhǎng)期生存風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估和預(yù)測(cè)，并為其制訂科學(xué)合理的隨訪復(fù)查與及時(shí)干預(yù)方案以達(dá)到改善肝癌患者術(shù)后長(zhǎng)期生存的目的，是臨床醫(yī)生和研究人員長(zhǎng)期努力的方向。既往作者實(shí)驗(yàn)室及其他實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果表明HBsAg[13]、Alb[14-15]、腫瘤大小[16]和BCLC分期[15,17]是肝癌患者長(zhǎng)期生存的獨(dú)立影響因素。而本研究中的結(jié)果也顯示這些指標(biāo)對(duì)肝癌患者術(shù)后的長(zhǎng)期生存有著一定的預(yù)測(cè)作用，同時(shí)這些風(fēng)險(xiǎn)因素也反映出肝癌患者的長(zhǎng)期生存風(fēng)險(xiǎn)是受到了病毒性肝炎、肝功能及腫瘤本身的綜合影響作用。

DAG是脂質(zhì)代謝過(guò)程中的中間產(chǎn)物，作為一種中性脂質(zhì)也是細(xì)胞膜的重要構(gòu)成成分；DAG經(jīng)DGK磷酸化后可產(chǎn)生PA[18]。在體內(nèi)許多的生物學(xué)進(jìn)程中，DAG和PA作為關(guān)鍵的第二信使執(zhí)行著特殊的功能任務(wù)，而DGK磷酸化DAG也是信使DAG的主要代謝方式[18]。不同亞型的DGK可以通過(guò)終止DAG信號(hào)和激活PA介導(dǎo)的通路來(lái)調(diào)控多種細(xì)胞內(nèi)過(guò)程。近年來(lái)，關(guān)于DGK在腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)進(jìn)程中的作用受到越來(lái)越多的重視。研究較多的是DGKα，目前已知其在乳腺癌[19]、子宮內(nèi)膜癌[20]、神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[21]和血液系統(tǒng)腫瘤[22]等惡性腫瘤中主要扮演著促癌基因的功能。這可能與腫瘤微環(huán)境能夠促進(jìn)DGKα的表達(dá)有關(guān)；一方面，DGKα介導(dǎo)生成的PA能夠促進(jìn)腫瘤的生存、遷移和耐藥性的產(chǎn)生；另一方面，DGKα所介導(dǎo)的DAG磷酸化代謝能夠減弱T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)并可使T淋巴細(xì)胞進(jìn)入無(wú)應(yīng)答狀態(tài)[10]。而在胃癌和結(jié)直腸癌中，DGKα的表達(dá)則是下調(diào)的，可能主要發(fā)揮了抑癌基因的功能[23-24]。對(duì)于肝癌，Takeishi等[25]研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的DGKα依賴(lài)于其激酶活性，可通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和腫瘤進(jìn)展。

不同于DGKα，作者的前期研究發(fā)現(xiàn)DGKγ可通過(guò)其激酶活性下調(diào)肝癌細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1的水平而發(fā)揮抑癌作用；而相比于肝癌組織中低表達(dá)DGKγ的患者，高表達(dá)組有著更長(zhǎng)的中位生存時(shí)間(21.17個(gè)月vs 32.87個(gè)月,P=0.009 2)[12]。然而，本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌旁組織中的DGKγ表達(dá)水平也是肝癌患者術(shù)后長(zhǎng)期生存的獨(dú)立影響因素，癌旁組織中DGKγ的水平越低，患者的術(shù)后總體生存越好；在BCLC不同分期的亞組分析中也得到了相似的結(jié)果。不同于DGKγ在癌組織中發(fā)揮抑癌因子的作用，癌旁組織中DGKγ的表達(dá)水平對(duì)肝癌患者術(shù)后生存影響的具體機(jī)制可能與DGKγ參與DAG和PA代謝進(jìn)而長(zhǎng)期影響肝臟的代謝功能有關(guān)。一方面，癌旁組織DGKγ LEP組中肝功能Child-Pugh B級(jí)患者占7.3%，要低于HEP組的16.2%；另一方面前者的PT要顯著地低于后者；這些差異提示了癌旁組織中DGKγ可能通過(guò)調(diào)節(jié)肝臟的合成代謝功能來(lái)影響肝癌患者的預(yù)后。

綜上所述，對(duì)于肝癌患者，癌旁組織中DGKγ的表達(dá)水平是術(shù)后長(zhǎng)期生存的獨(dú)立影響因素，可能是一種新的肝癌預(yù)后指標(biāo)；其能夠在一定程度上幫助臨床醫(yī)師對(duì)術(shù)后患者的長(zhǎng)期生存風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)和評(píng)估，從而更好地幫助臨床決策。此外，本研究尚存在著樣本量少的局限性，擴(kuò)大研究的樣本量及探索相關(guān)的具體作用機(jī)制是下一步的研究方向。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：錢(qián)相君、郭正陽(yáng)負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，收集數(shù)據(jù)，資料分析和撰寫(xiě)論文；王莉、聶涵笑參與收集數(shù)據(jù)；賀濤、王效謙、萬(wàn)百順參與修改論文；姚明解、張玲負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。