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      微RNA風(fēng)險評分模型預(yù)測肝細胞癌預(yù)后的價值分析

      2021-05-17 10:01:08黃秀紅謝肖立姜慧卿
      臨床肝膽病雜志 2021年5期
      關(guān)鍵詞:曲線測試差異

      黃秀紅,謝肖立,姜慧卿

      河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 消化內(nèi)科,石家莊 050000

      肝細胞癌(HCC)是最常見的原發(fā)性肝癌,其發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排第6位,致死率排第4位,世界衛(wèi)生組織估計,截至2030年,全球每年將有超過100萬死于HCC的患者[1-2]。由于HCC起病隱匿,進展迅速且異質(zhì)性高,盡管外科手術(shù)、射頻消融、化學(xué)栓塞甚至肝移植已廣泛用于HCC治療,但HCC患者的存活率仍然較低[3-4]。由于與HCC發(fā)生和發(fā)展有關(guān)的生物學(xué)過程非常復(fù)雜,迄今為止尚無敏感高效的預(yù)后生物標志物,因此,有必要探索新的能夠高效預(yù)測HCC預(yù)后的生物標志物或模型,用于HCC的診斷、預(yù)后和治療。

      微RNA(microRNA,miRNA)是一類參與mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的非編碼小RNA,通過與目標mRNA的3′非編碼區(qū)結(jié)合,抑制轉(zhuǎn)譯或降解mRNA,繼而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達,從而影響細胞生物學(xué)功能,miRNA的差異表達在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5-6],而且多項研究[7-9]已經(jīng)確定miRNA模型能夠預(yù)測惡性腫瘤患者的預(yù)后,比如乳腺癌、前列腺癌及卵巢癌。而在本次研究中,首先從TCGA中下載HCC基因及臨床數(shù)據(jù),隨后找出與HCC預(yù)后相關(guān)的miRNA,構(gòu)建預(yù)測HCC預(yù)后的miRNA風(fēng)險評分模型,并驗證其檢驗效能。

      1 資料與方法

      1.1 數(shù)據(jù)下載與整理 從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中下載HCC miRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)。

      1.2 差異分析 利用R語言的limma包對HCC與正常肝組織之間的miRNA進行基因差異表達對比分析,并設(shè)置差異倍數(shù)log2FC(fold change,F(xiàn)C)>1.0且P<0. 01。

      1.3 miRNA風(fēng)險評分模型的構(gòu)建 從臨床數(shù)據(jù)中提取生存信息,包括生存時間和生存狀態(tài),與差異表達的miRNA進行整合,利用R語言caret包將其隨機分成訓(xùn)練集和測試集,利用survival、glmnet、survminer包對訓(xùn)練集進行單因素Cox回歸分析,并設(shè)定P<0.01為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。然后通過10倍交叉驗證的LASSO-Cox回歸分析進一步篩選預(yù)后miRNA,并計算每個miRNA的危險比(HR)和回歸系數(shù),基于miRNA表達水平及回歸系數(shù)的線性組合構(gòu)建與HCC預(yù)后相關(guān)的風(fēng)險評分模型。

      1.4 miRNA風(fēng)險評分模型的驗證 根據(jù)風(fēng)險評分模型計算出訓(xùn)練集中每個樣本的風(fēng)險得分,并根據(jù)中位風(fēng)險得分值將樣本分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組,采用log-rank檢驗的Kaplan-Meier生存曲線評估高風(fēng)險組與低風(fēng)險組的預(yù)后差異,組間差異比較時設(shè)定P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,同時在測試集中評估其穩(wěn)健性。為了評估該模型是否可以預(yù)測同一臨床分期的患者預(yù)后,對不同TNM分期的患者進行了分層分析,將HCC患者分為低TNM組(Ⅰ和Ⅱ期)和高TNM組(Ⅲ和Ⅳ期),同樣采用log-rank檢驗的Kaplan-Meier生存曲線評估高TNM組和低TNM組的預(yù)后差異,并設(shè)定P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

      1.5 miRNA風(fēng)險評分模型的評估 通過R語言的survival ROC包繪制ROC曲線,計算出ROC曲線下面積(AUC),并與傳統(tǒng)TNM分期比較,評估該模型的預(yù)測準確性,其中AUC> 0.7被認為具有良好的預(yù)測效能。最后對風(fēng)險評分模型和臨床特征進行單因素和多因素Cox回歸分析評估該模型預(yù)后獨立性,并設(shè)定P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 一般資料 miRNA樣本共425例,包括375例HCC樣本及50例癌旁樣本,并將臨床數(shù)據(jù)中生存時間、生存狀態(tài)及TNM分期缺失的數(shù)據(jù)刪除,獲得臨床數(shù)據(jù)352例(表1)。

      表1 TCGA數(shù)據(jù)庫HCC患者的臨床數(shù)據(jù)

      2.2 差異表達的miRNA 利用R語言對HCC及癌旁組織進行miRNA差異表達分析,以log2FC>1.0 且P<0.01 為標準,共篩選出300個差異表達miRNAs,上調(diào)基因260個,下調(diào)基因40個。

      2.3 miRNA風(fēng)險評分模型的構(gòu)建 將差異表達的miRNA與臨床數(shù)據(jù)進行整合匹配,共得到347個樣本,利用R語言將其按照1∶1隨機分成訓(xùn)練集(n=175)和測試集(n=172),對訓(xùn)練集依次進行單因素Cox及10倍交叉驗證的LASSO-Cox回歸分析。單因素Cox回歸分析顯示,23個miRNAs與HCC預(yù)后相關(guān)(P<0.01)。然后通過LASSO回歸進一步篩選miRNA,結(jié)果顯示9個miRNAs: hsa-miR-139-5p、hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-4652-5p、hsa-miR-1269b、hsa-miR-122b-5p、hsa-miR-3677-5p、hsa-miR-3680-3p、hsa-miR-509-3-5p、hsa-miR-31-5p與HCC預(yù)后顯著相關(guān)(圖1)。

      最后將LASSO回歸篩選出的miRNAs擬合到多因素Cox回歸分析,最終確定了包括hsa-miR-139-5p、hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-1269b、hsa-miR-3680-3p、hsa-miR-509-3-5p、hsa-miR-31-5p在內(nèi)的6個miRNAs,構(gòu)建風(fēng)險評分公式并繪制森林圖(圖2)。風(fēng)險評分公式:hsa-miR-139-5p×(-0.001 07)+hsa-miR-1180-3p×0.001 57+hsa-miR-1269b×0.000 26+hsa-miR-3680-3p×0.162 79+hsa-miR-509-3-5p×0.002 46+hsa-miR-31-5p×0.010 67,計算每個樣品的風(fēng)險得分。在這些miRNAs中,hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-1269b、hsa-miR-3680-3p、hsa-miR-509-3-5p、hsa-miR-31-5p的系數(shù)為正,表明這些基因表達水平越高,生存期越短,而hsa-miR-139-5p的系數(shù)為負,表明該基因表達水平越高,生存期越長。

      2.4 miRNA風(fēng)險評分模型的驗證 根據(jù)miRNA風(fēng)險評分模型,計算訓(xùn)練集中每個樣本的風(fēng)險得分,再根據(jù)中位風(fēng)險得分值(n=0.918 637 4)將訓(xùn)練集分為高風(fēng)險組(n=87)和低風(fēng)險組(n=88)。生存曲線顯示(圖3a)高風(fēng)險組患者的生存率明顯低于低風(fēng)險組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同樣地,根據(jù)相同的風(fēng)險評分模型及中位風(fēng)險得分值(n=0.918 637 4),將測試集中的患者分為高風(fēng)險組(n=81)和低風(fēng)險組(n=91),生存曲線顯示(圖3b),高風(fēng)險組患者的生存率明顯低于低風(fēng)險組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

      注:a,LASSO篩選與生存相關(guān)的miRNAs;b,與HCC患者預(yù)后相關(guān)的miRNAs的LASSO系數(shù)。

      注:**,P<0.01;***,P<0.001。

      隨后根據(jù)樣本的風(fēng)險得分排名,分別繪制訓(xùn)練集和測試集的風(fēng)險圖、生存狀態(tài)圖及與HCC預(yù)后相關(guān)的6個miRNAs的風(fēng)險熱圖(圖4、5)。結(jié)果表明高風(fēng)險評分的患者預(yù)后較差,且系數(shù)為正的miRNAs(hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-1269b、hsa-miR-3680-3p、hsa-miR-509-3-5p、hsa-miR-31-5p)表達上調(diào),而低風(fēng)險評分的患者預(yù)后較好,且系數(shù)為負的miRNA(hsa-miR-139-5p)表達上調(diào)。

      注:a,訓(xùn)練集生存曲線;b,測試集生存曲線。

      將患者按TNM分期分為低TNM組(Ⅰ和Ⅱ期)和高TNM組(Ⅲ和Ⅳ期),Kaplan-Meier曲線顯示低TNM組、高TNM組的高風(fēng)險患者的生存率顯著低于低風(fēng)險患者(P<0.05),表明該模型可以預(yù)測同一臨床分期的患者預(yù)后。

      注:a,訓(xùn)練集風(fēng)險圖;b,訓(xùn)練集生存狀態(tài)圖;c,訓(xùn)練集風(fēng)險熱圖

      注:a,測試集風(fēng)險圖;b,測試集生存狀態(tài)圖;c,測試集風(fēng)險熱圖。

      2.5 miRNA風(fēng)險評分模型的評估 利用R語言繪制miRNA模型及TNM分期的ROC曲線并計算AUC,結(jié)果顯示訓(xùn)練集(圖7a)中,miRNA模型及TNM分期的AUC分別為0.817、0.667,測試集(圖7b)分別為0.808、0.665,及合集樣本(圖7c)分別為0.814、0.663,miRNA模型預(yù)測準確性均優(yōu)于TNM分期。

      將年齡、性別、腫瘤分級、TNM分期、miRNA評分分別進行單因素、多因素Cox獨立預(yù)后分析,單因素分析結(jié)果顯示T分期、M分期、TNM分期及miRNA評分是HCC患者預(yù)后的相關(guān)因素(P值均<0.05)(圖8a),多因素分析結(jié)果顯示miRNA評分模型可作為HCC的獨立預(yù)后因子(P<0.05)(圖8b)。

      注:a,低TNM組(Ⅰ和Ⅱ期)生存曲線;b,高TNM組(Ⅲ和Ⅳ期)生存曲線。

      注:a,miRNA模型和TNM分期在訓(xùn)練集的ROC曲線;b,miRNA模型和TNM分期在測試集的ROC曲線;c,miRNA模型和TNM

      注:a,單因素分析;b,多因素分析。

      3 討論

      原發(fā)性肝癌是常見的惡性腫瘤,在各個年齡段均可發(fā)病,發(fā)病率和死亡率比較高,預(yù)后很差。目前,用于預(yù)測HCC預(yù)后主要依據(jù)傳統(tǒng)的TNM分期[10],盡管TNM分期在惡性腫瘤的診斷和治療中起著重要作用,但由于腫瘤的異質(zhì)性和個體差異,其無法反映內(nèi)部的生物學(xué)過程和疾病進展,因此有必要尋找一種新的能夠高效預(yù)測HCC預(yù)后的生物標志物或模型,輔助臨床工作。

      在本次研究中,首先從TCGA中下載HCC的miRNA表達量及臨床數(shù)據(jù),TCGA是由美國國立衛(wèi)生研究院支持發(fā)起的,包括30多種癌癥,旨在提供不同癌癥的全面基因分析并建立與臨床結(jié)果的相關(guān)性,這些數(shù)據(jù)對于癌癥的研究具有巨大的潛力,并且已經(jīng)利用這些數(shù)據(jù)取得了許多成果[11-16]。當作者試圖從訓(xùn)練集中確定預(yù)后特征時,由于樣本量小,基因數(shù)量眾多,因此對訓(xùn)練集中的數(shù)據(jù)進行了10倍交叉驗證的LASSO-Cox回歸分析。其中LASSO是一種創(chuàng)新的回歸變量選擇方法,在系數(shù)的絕對值之和小于一個常數(shù)的情況下將殘差平方和最小化,從而使某些回歸系數(shù)嚴格等于0,從而選擇出對因變量影響較大的自變量,是通過構(gòu)造一個懲罰函數(shù)得到一個較為精煉的模型[17],從而減少模型的過度擬合。而交叉驗證法是比較常用的推測估計懲罰系數(shù)λ的方法,而λ值最終是由使平均交叉驗證誤差最小的最小化λ確定的。然后根據(jù)Cox多因素回歸分析,得出和HCC預(yù)后相關(guān)的6種miRNAs。通過回顧已發(fā)表的文獻[18-20],作者發(fā)現(xiàn) miRNA的失控與HCC的發(fā)生、耐藥、預(yù)后相關(guān),廣泛參與HCC中腫瘤抑制基因的失活和癌基因的激活。其中hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-1269b、hsa-miR-3680-3p、hsa-miR-509-3-5p、hsa-miR-31-5p的表達在HCC組織中上調(diào),可能起致癌作用,hsa-miR-139-5p在HCC組織中的表達下調(diào),可能起抑癌作用,而hsa-miR-139-5p可以通過減少SLITRK4的表達抑制HCC細胞的生長[21]。然后基于回歸系數(shù)構(gòu)建了風(fēng)險評分模型,計算出訓(xùn)練集中每位患者的風(fēng)險得分,然后根據(jù)中位風(fēng)險得分值將其分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組,并在測試集中驗證了該miRNA風(fēng)險評分模型的預(yù)后價值。生存曲線分析表明,訓(xùn)練集、測試集的高風(fēng)險組和低風(fēng)險組的生存曲線均觀察到明顯的分離(P值均<0.05)。為了檢驗該模型預(yù)測效能,繪制了ROC曲線,并計算了相應(yīng)的AUC,將其與傳統(tǒng)TNM分期比較,結(jié)果顯示在訓(xùn)練集、測試集及合集樣本中miRNA模型的預(yù)測準確性均優(yōu)于TNM分期。最后將年齡、性別、分級、分期、miRNA評分模型分別進行單因素、多因素Cox獨立預(yù)后分析,結(jié)果顯示該miRNA評分模型可作為HCC的獨立預(yù)后因子。該模型與傳統(tǒng)TNM分期相比較,能夠更好地反應(yīng)內(nèi)在生物學(xué)進程和疾病進展,受主觀因素影響少,且該預(yù)測模型具有可評估性和可重復(fù)性等優(yōu)點,可與傳統(tǒng)TNM分期互補,共同應(yīng)用于臨床工作。同時本研究也有一定的不足,所有分析均通過TCGA數(shù)據(jù)庫完成,以后可同時設(shè)置內(nèi)部驗證集和外部驗證集(如GEO數(shù)據(jù)庫)驗證該模型預(yù)測準確性,而且未進行相關(guān)實驗,這些都有待進一步研究工作。

      利益沖突聲明:本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

      作者貢獻聲明:黃秀紅負責(zé)醞釀和設(shè)計實驗,下載、分析數(shù)據(jù),統(tǒng)計分析,論文撰寫;謝肖立負責(zé)協(xié)助論文修改;姜慧卿負責(zé)研究指導(dǎo)、論文修改。

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