AU結合因子1對肝細胞癌患者磷脂酰肌醇蛋白聚糖3水平的影響

張 婷，關貴文，張 婧，魯鳳民，陳香梅

北京大學基礎醫(yī)學院 病原生物學系，北京大學感染病研究中心，北京 100191

肝細胞癌(HCC)是全球常見的惡性腫瘤之一, 位列癌癥相關死亡率的第四位[1-2]。盡管最近在HCC臨床治療方面取得了很多進展，但其治療效果仍然欠佳，HCC術后5年生存率只有15%[3]。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)是一種硫酸肝素蛋白聚糖，位于細胞膜表面，在細胞增殖和分化中發(fā)揮重要作用[4-5]。研究[6-7]表明，GPC3在HCC中呈異常高表達，且具有很強的腫瘤特異性，被認為是HCC關鍵驅動分子。此外，GPC3表達水平與HCC的發(fā)生發(fā)展及預后密切相關，可作為HCC的診斷標志物和治療靶點[4,8-9]。但GPC3在HCC中異常表達的機制尚未完全闡明。

腺苷酸-尿嘧啶富集元件(AU-rich elements，AREs)位于mRNA的3′UTR區(qū)，是最具特征的mRNA降解順式作用因子。AREs可被ARE結合蛋白識別并結合，進而調控mRNA的穩(wěn)定性及翻譯[10-11]。AU結合因子1(AU-rich element RNA-binding factor 1，AUF1)也稱異質核糖核蛋白D(hnRNPD)，是第一個被鑒定出的ARE結合蛋白[12-13]。大量研究[14-15]表明，AUF1高親和力結合富含AREs元件的mRNA并調控其穩(wěn)定性。本研究中，首次發(fā)現(xiàn)GPC3 mRNA的3′UTR區(qū)含有AREs序列，AUF1可結合GPC3 mRNA，增強其穩(wěn)定性，從而上調HCC中GPC3的表達。

1 材料與方法

1.1 TCGA、LCI數(shù)據(jù)庫 TCGA-HCC基因表達數(shù)據(jù)下載自美國Bead研究所基因數(shù)據(jù)分析中心(http：//gdac.broadinstitute.org)。采用FPKM (fragments per kilobase million) 法對TCGA轉錄組測序數(shù)據(jù)進行標準化，最終納入371例不同病因的HCC組織及50例癌旁組織。

LCI-HCC基因表達數(shù)據(jù)下載自GSE14520(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo), 最終納入214例有隨訪信息的乙型肝炎相關HCC患者。

1.2 臨床標本 35例HCC及配對癌旁樣本選取自2009年—2013年在河南省腫瘤醫(yī)院接受常規(guī)根治性手術的HCC患者。所有患者均經(jīng)病理診斷確診，且均未在手術前接受任何化學療法或放射療法。

1.3 肝癌細胞系 HepG2細胞購自美國ATCC細胞庫，Huh-7細胞購自中國科學院上海細胞庫。使用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達約80%時，用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代，取生長至對數(shù)期的細胞用于實驗研究。

1.4 主要材料與試劑 siRNA購自廣州銳博生物；pcdh-AUF1質粒為本實驗室構建保存；細胞DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco公司；轉染試劑LipofectamineTMRNAiMAX Transfection Reagent、LipofectamineTM2000、Trizol、Protein A磁珠及蛋白定量試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑購自美國Roche公司；RNA合成抑制劑Actinomycin D和兔抗AUF1抗體購自Abcam公司；鼠抗人GPC3抗體和鼠抗人Tubulin抗體購自美國SantaCruz公司。

1.5 免疫組化實驗 將石蠟塊切成5 mm的切片，并用蘇木精和曙紅染色。使用AUF1和GPC3抗體染色并通過DAKO EnVision顯色系統(tǒng)檢測，采用Aperio Scan Scope GL虛擬掃描成像系統(tǒng)，并用Visio pharm軟件進行分析。根據(jù)染色強度和對應的陽性細胞百分比對染色切片進行評分[15]：0分，陰性，0%；1分，弱陽性，<25%；2分，適中，25%～50%；3～4分，強陽性，> 50%。

1.6 細胞轉染實驗 轉染前1天進行細胞傳代并細胞計數(shù)，按照4×105個/孔將細胞接種于6孔板中。按照LipofectamineTMRNAiMAX的說明書，將siAUF1與對照siNC轉染至HepG2與Huh-7細胞中。AUF1外源表達質粒和空載對照按照LipofectamineTM2000說明書進行轉染。轉染6 h后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并于轉染48 h后收集細胞，用于后續(xù)實驗研究。

1.7 Western-Blot實驗 收集細胞沉淀，加入RIPA裂解液進行細胞裂解，BCA試劑測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉，一抗4 ℃孵育過夜。二抗室溫孵育1 h。用美國LI-COR公司 Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)采集圖像，使用Tubulin作為內參。

1.8 細胞RNA提取和qRT-PCR 按照Trizol試劑說明書提取細胞總RNA，用Nano-Drop2000測定RNA濃度。以1 μg總RNA為模板，用隨機引物逆轉錄合成cDNA鏈。取1 μl逆轉錄產(chǎn)物，用SYBRGREEN法進行qRT-PCR。以管家基因C-TBP1作為內參，采用2-△△CT方法對目的基因的相對表達進行分析，實驗所用引物序列如下。GPC3：F5′-GCGGTTACTGCAATGTGGTC-3′，R5′-TCTCAGTTTCAGTGGTGGTC-3′；AUF1：F5′-GATCAAGGGGTTTTGGCTTT-3′，R5′-GTTGTCCATGGGGACCTCTA-3′；C-TBP1：F5′-TTCACCGTCAAGCAGATGAGAC-3′，R5′-CTGGCTAAAGCTGAAGGGTTCC-3′。

1.9 RNA結合蛋白免疫沉淀實驗 取1×107細胞加入350 μl RIP裂解液進行細胞裂解。將AUF1抗體或同型IgG對照與Protein A磁珠孵育2 h，洗去未結合的抗體后加入細胞裂解液上清，4 ℃孵育過夜。依次加入蛋白酶K和DNase I，消化蛋白和DNA。使用苯酚氯仿提取和乙醇沉淀分離出共沉淀的RNA，用qRT-PCR法定量檢測GPC3表達。

1.10 RNA半衰期檢測 將siAUF1與對照siNC轉染HepG2與Huh-7細胞，48 h后，向細胞培養(yǎng)基中加入放線菌素D(5 mg/ml)抑制新的RNA合成。在加藥處理后0、2、4、6 h，收集細胞并提取RNA，qRT-PCR法檢測GPC3表達。

1.11 倫理學審查 本研究經(jīng)北京大學醫(yī)學部倫理委員會的批準，批號：IRB00001052-12088，并已獲得所有患者的知情同意。

1.12 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 24.0和GraphPad Prism5軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料兩組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料兩組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法進行生存分析，并使用log-rank檢驗進行生存率的比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 GPC3和AUF1 mRNA在開放數(shù)據(jù)庫HCC中的表達及相關性 GPC3 mRNA在HCC組織中的表達水平顯著高于癌旁組織(P值均<0.05)(圖1)。在TCGA-HCC數(shù)據(jù)庫中，GPC3 mRNA高表達的HCC患者5年總體生存率顯著低于GPC3 mRNA低表達患者(P<0.05)；在LCI數(shù)據(jù)庫中，GPC3 mRNA表達對與乙型肝炎相關HCC患者的預后無關(圖2)。AUF1 mRNA在HCC組織中的表達水平明顯高于癌旁組織(P值均<0.05)(圖3)。

圖1 TCGA、LCA數(shù)據(jù)庫中GPC3 mRNA的表達水平

圖2 TCGA、LCI數(shù)據(jù)庫中GPC3表達水平與HCC患者預后的關系

圖3 TCGA、LCI數(shù)據(jù)庫中AUF1 mRNA的表達水平

2.2 GPC3與AUF1蛋白在HCC組織中呈高表達 采用免疫組化方法檢測了35例HCC樣本中GPC3和AUF1蛋白的表達水平。結果顯示，GPC3在HCC組織中高表達，大部分HCC細胞的胞膜和胞質中均可檢測到GPC3，其中20例為強陽性染色(≥3分)、7例為中度陽性染色(2分)、8例染色較弱或呈陰性(<2分)。而在非腫瘤肝組織中幾乎檢測不到GPC3表達(圖4)。AUF1也在HCC組織中呈高表達，顯示出較強的胞核著色，其中16例為強陽性染色(≥3分)、10例為中度陽性染色(2分)、9例染色較弱或呈陰性(<2分)(圖4)。

圖4 GPC3與AUF1在HCC及癌旁組織中免疫組化染色結果

進一步分析顯示，GPC3和AUF1蛋白均在HCC組織中呈高表達，陽性表達率分別為77.1%(27/35)和74.3%(26/35)。65.7%(23/35)的HCC組織中GPC3和AUF1均呈高表達。在27例GPC3陽性組中，23例(23/27,85.2%,)AUF1染色呈陽性，顯著高于GPC3陰性組中AUF1陽性表達率(3/8，37.5%)(χ2=7.35，P<0.05)，提示HCC中AUF1可能調控GPC3的表達。

2.3 AUF1上調GPC3的表達 為了明確GPC3的表達是否受AUF1蛋白調控，在HCC細胞系中檢測了AUF1敲減及過表達對GPC3表達的影響。結果表明，敲減AUF1顯著下調了HepG2和Huh-7中的GPC3蛋白和mRNA水平(圖5a)。相反，在Huh-7細胞中過表達AUF1則上調了GPC3蛋白和mRNA水平(圖5b)。

注：a，敲減AUF1后，GPC3蛋白和mRNA水平；b,過表達AUF1后，GPC3蛋白和mRNA水平。

2.4 AUF1結合并穩(wěn)定GPC3 mRNA 通過分析GPC3 mRNA的3′UTR區(qū)發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域富含尿嘧啶，具有典型的AREs序列(圖6a)。RNA結合蛋白免疫沉淀實驗結果表明，HepG2和Huh-7細胞中的AUF1蛋白可結合GPC3 mRNA(圖6b)。在HepG2和Huh-7細胞中敲減AUF1后，GPC3 mRNA的降解速度明顯加快(圖6c、d)，提示AUF1蛋白可以穩(wěn)定GPC3 mRNA。

注：a,GPC3 3′UTR區(qū)潛在的AUF1結合位點示意圖；b，RNA結合蛋白免疫沉淀實驗檢測AUF1與GPC3 mRNA結合；c、d，RNA半衰期實驗檢測AUF1敲減對GPC3 mRNA降解速度的影響。

3 討論

GPC3在HCC中呈異常高表達，已成為HCC的免疫治療靶標[16]。既往研究表明，GPC3在HCC中異常表達可能與Myc的轉錄激活[17]和GPC3拷貝數(shù)增加[18]有關，但其具體機制尚未完全闡明。本研究探索了RNA結合蛋白AUF1對GPC3表達的調控作用，發(fā)現(xiàn)HCC細胞中AUF1蛋白可以結合并穩(wěn)定GPC3 mRNA，進而上調GPC3表達。本研究首次揭示了HCC中GPC3異常表達的轉錄后調控機制，將為研發(fā)HCC新的治療靶點提供依據(jù)。

GPC3是肝臟中的關鍵腫瘤驅動分子，與HCC的發(fā)生、發(fā)展和預后密切相關。與文獻報道結果一致，本研究發(fā)現(xiàn)GPC3 mRNA水平在TCGA和LCI數(shù)據(jù)庫所納入的HCC組織中均顯著高于癌旁組織，且在TCGA數(shù)據(jù)庫中GPC3高表達的HCC患者5年總體生存率更低，提示GPC3高表達與HCC患者的不良預后有關。但在LCI數(shù)據(jù)庫納入的乙型肝炎相關HCC患者中，未見GPC3高表達與HCC患者不良預后有關。近年來基于高通量測序的研究[19]表明，與非乙型肝炎HCC不同，乙型肝炎相關HCC的分子分型以增殖型為主，且其組織學具有更高的侵襲性特征，包括細胞分化程度更低、更多的染色體不穩(wěn)定及TP53突變等，提示乙型肝炎相關HCC發(fā)生發(fā)展中還有其特定的驅動因素。GPC3高表達在不同感染背景相關HCC中的預后作用不同，可能與乙型肝炎相關HCC更復雜的致病機制有關，但需要更深入的研究來確證。

AREs序列廣泛存在于基因的3′UTR區(qū)，包括編碼多種炎癥因子、原癌基因、生長因子、細胞周期蛋白的基因。AREs序列可以被RNA結合蛋白識別，包括AUF1、HUR、TTP等[10-11]。AUF1是最早被發(fā)現(xiàn)的ARE結合蛋白，在包括HCC、乳腺癌、甲狀腺癌等多種腫瘤中表達上調[14-15]。通過數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，HCC組織中的AUF1呈異常高表達，與文獻報道一致。采用免疫組化方法進一步證實GPC3和AUF1蛋白在HCC組織中也呈高表達，且二者的表達水平呈正相關。以往研究[14-15]多認為AUF1與ARE結合后，發(fā)揮降解靶基因mRNA的作用，并進而抑制基因的表達。但近年有研究[14]發(fā)現(xiàn)，AUF1也可以穩(wěn)定mRNA，并上調基因的表達，如食管癌中AUF1通過穩(wěn)定mRNA上調GCH1蛋白表達。本研究發(fā)現(xiàn)，GPC3 mRNA的3′UTR區(qū)含有AREs序列，在HCC細胞中敲減AUF1能顯著下調GPC3的表達水平，而過表達AUF1則上調GPC3表達。更為重要的是，HCC細胞中AUF1蛋白能與GPC3 mRNA結合，敲減AUF1后GPC3 mRNA的半衰期明顯縮短。鑒于AUF1蛋白可以結合并穩(wěn)定GPC3 mRNA，推測GPC3是AUF1調控的靶基因之一，HCC中AUF1的高表達是導致GPC3上調的一個重要機制。

由于AUF1是通過蛋白質結合GPC3 mRNA從而上調其表達水平，是轉錄后水平調控，因此在HCC數(shù)據(jù)庫分析中并沒有發(fā)現(xiàn)AUF1 mRNA與GPC3 mRNA水平間存在顯著相關性。此外，已有文獻[17]報道Myc可轉錄激活GPC3基因的表達，且HCC中還存在GPC3基因拷貝數(shù)增加，提示HCC組織中GPC3的表達上調包括基因組水平和轉錄水平的調控。

綜上，本研究結果表明RNA結合蛋白AUF1是GPC3基因的新調控因子，可在轉錄后水平上調GPC3的表達，AUF1和GPC3蛋白的異常高表達可能參與了HCC的發(fā)生和發(fā)展。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：張婷負責課題的實施與論文撰寫；關貴文、張婧負責數(shù)據(jù)庫分析與圖表整理；魯鳳民參與修改完善論文；陳香梅負責課題設計，指導撰寫文章并最后定稿。