杜健磊, 張彥旭,王俊蘋(píng)

（1.駐馬店市中心醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 駐馬店 463000；2.駐馬店市第二人民醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 駐馬店 463000）

天麻祛風(fēng)補(bǔ)片具有溫腎養(yǎng)肝、祛風(fēng)止痛等功效，臨床常用于治療肝腎虧損、風(fēng)濕入絡(luò)所致的痹病，如頭暈耳鳴、關(guān)節(jié)疼痛、腰膝痠軟、畏寒肢冷、手足麻木等癥的治療[1-4]。該品種系由天麻、地黃、當(dāng)歸、羌活、獨(dú)活、附片、肉桂、杜仲、川牛膝、玄參等11味藥材加工制成，方中天麻為君藥，具有息風(fēng)止痙，平抑肝陽(yáng)，祛風(fēng)通絡(luò)之功效[5-8]，地黃為臣藥，具有淸熱涼血，養(yǎng)陰生津之功效[9-12]，玄參為佐藥，具有清熱涼血，滋陰降火，解毒散結(jié)之功效[13-16]。該品種現(xiàn)收載于2015版《中國(guó)藥典》中，標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定項(xiàng)為天麻素，僅針對(duì)君藥天麻進(jìn)行質(zhì)量控制[17]。為保障人民群眾的用藥安全，本研究建立天麻祛風(fēng)補(bǔ)片中天麻素、哈巴苷和梓醇含量測(cè)定的高效液相色譜（HPLC）分析方法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Shimadzu LC-2010 AHT型高效液相色譜儀（在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器、LC-Solution工作站，島津科技有限公司）；Sartorius Quintix513-1CN型萬(wàn)分之一電子天平（賽多利斯科技有限公司）；Fuyang F-040S型小型超聲儀（容積：10 L，蘇州邁弘電器有限公司）。

1.2 試藥

天麻素對(duì)照品（批號(hào)：110807-201809，含量以96.7 %計(jì)）；哈巴苷對(duì)照品（批號(hào)：111729-201707，含量以96.8 %計(jì)）；梓醇對(duì)照品（批號(hào)：110808-201711，含量以99.6 %計(jì)），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；天麻祛風(fēng)補(bǔ)片（昆明中藥廠有限公司，規(guī)格：糖衣片，片心重0.35 g，批號(hào)：191012，191223，200116）；甲醇、乙腈均為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Spherisorb ODS-1 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1 %磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，1 % A；8～13 min，1 %A～12 % A；13～24 min，12 %A～48 % A；24～28 min，48 %A～82 %A；28～31 min，82 %A～1 % A；31～36 min，1 % A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：216 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別取梓醇對(duì)照品、天麻素對(duì)照品和哈巴苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置50 ml量瓶中，加80 %甲醇制成每1 ml含梓醇0.996 mg、天麻素0.484 mg和哈巴苷0.581 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液；再精密量取2.5 ml，置25 ml量瓶中，加80 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取天麻祛風(fēng)補(bǔ)片（批號(hào)：191012）20片，除去包衣，精密稱(chēng)定，研細(xì)，取約2.0 g，精密稱(chēng)定，置50 ml量瓶中，加80 %甲醇約30 ml，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）25 min，取出放冷至室溫，加80 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按天麻祛風(fēng)補(bǔ)片處方比例及制備工藝，制備缺地黃、天麻和玄參的陰性對(duì)照樣品，陰性對(duì)照樣品按供試品溶液制備方法處理，制得陰性對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 分別精密吸取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μl，按2.1項(xiàng)下色譜條件注入高效液相色譜儀，采集色譜圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)供試品溶液色譜圖中梓醇、天麻素和哈巴苷色譜峰保留時(shí)間與對(duì)照品溶液一致，且3種活性成分分離良好，陰性對(duì)照溶液色譜圖無(wú)干擾峰存在，表明方法專(zhuān)屬性良好。見(jiàn)圖1

圖1 典型色譜圖

2.3.2 精密度考察 取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μl，采集色譜圖，依據(jù)6次進(jìn)樣所得色譜圖中梓醇、天麻素和哈巴苷峰面積計(jì)算RSD。結(jié)果梓醇峰面積RSD為1.12 %，天麻素峰面積RSD為0.91 %，哈巴苷峰面積RSD為0.78 %，表明儀器精密度良好。

2.3.3 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，加80 %甲醇制備含梓醇、天麻素和哈巴苷系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，上述溶液分別精密吸取10μl，按2.1項(xiàng)下色譜條件注入高效液相色譜儀，采集色譜圖。分別以梓醇、天麻素和哈巴苷峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算曲線方程。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)天麻祛風(fēng)補(bǔ)片（批號(hào)：191012）共6份，按2.2.2項(xiàng)下制備供試品溶液，分別精密吸取上述溶液各10 μl，按2.1項(xiàng)下色譜條件注入高效液相色譜儀，采集色譜圖。分別計(jì)算梓醇、天麻素和哈巴苷含量，以6次含量測(cè)定結(jié)果計(jì)算RSD。結(jié)果梓醇、天麻素和哈巴苷平均含量分別為0.4167，0.1936，0.5021 mg/片；重復(fù)性RSD分別為2.01 %，2.37 %，1.63 %，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.3.4項(xiàng)下供試品溶液，于室溫下分別放置0，2，4，6，9，12，24 h，各精密吸取10 μl，按2.1項(xiàng)下色譜條件注入高效液相色譜儀，采集色譜圖。結(jié)果梓醇峰面積的RSD為1.72 %，天麻素峰面積RSD為2.11 %，哈巴苷峰面積RSD為1.16 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定梓醇、天麻素和哈巴苷含量的天麻祛風(fēng)補(bǔ)片（批號(hào)：191012）共6份，每份約2.0 g，精密稱(chēng)定，置50 ml量瓶中，精密加入2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液；分別精密吸取上述溶液各10 μl，按2.1項(xiàng)下色譜條件注入高效液相色譜儀，采集色譜圖；計(jì)算梓醇、天麻素和哈巴苷的加標(biāo)回收率。見(jiàn)表2。

表2 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品測(cè)定

取天麻祛風(fēng)補(bǔ)片（昆明中藥廠有限公司，批號(hào)：191012，191223，200116），分別按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取上述溶液各10 μl，按2.1項(xiàng)下色譜條件注入高效液相色譜儀，采集色譜圖，計(jì)算樣品中梓醇、天麻素和哈巴苷的含量。見(jiàn)表3。

表3 含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 活性成分的選擇

天麻祛風(fēng)補(bǔ)片是由天麻、地黃、玄參、當(dāng)歸、羌活等11味藥材經(jīng)打粉、混合、煎煮等工序加工制成的中藥片劑，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中以天麻藥材中天麻素為含量測(cè)定項(xiàng)，不能較全面地體現(xiàn)該產(chǎn)品的質(zhì)量水平。本文選擇藥材組成中君藥天麻、臣藥地黃、佐藥玄參，與其相對(duì)應(yīng)的活性成分為天麻素、梓醇、哈巴苷，采用HPLC同時(shí)檢測(cè)3種活性成分的含量，能更為全面地體現(xiàn)該品種的質(zhì)量水平。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液，精密吸取10 μl，按2.1項(xiàng)下色譜條件注入高效液相色譜儀，設(shè)置光譜采集波長(zhǎng)在200～400 nm范圍，采集光譜圖（見(jiàn)圖2）。由光譜圖可見(jiàn)，梓醇在210 nm、天麻素在219 nm、哈巴苷在210 nm處有最大吸收，綜合3種活性成分的紫外響應(yīng)，最終確定216 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖2 3種成分紫外光譜圖

3.3 提取方法的優(yōu)化

分別選擇甲醇、90 %甲醇、80 %甲醇和70 %甲醇作為提取溶劑，考察溶劑對(duì)提取效果的影響。結(jié)果選擇80 %甲醇作為提取劑時(shí)，提取效果最佳；再分別考察超聲功率和提取時(shí)間的影響，最終確定最佳提取條件為：80 %甲醇作為提取溶劑，超聲功率250 W，時(shí)間25 min。

綜上，本文建立天麻祛風(fēng)補(bǔ)片中天麻素、哈巴苷和梓醇活性成分含量測(cè)定的HPLC分析方法，該方法具有簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可作為天麻祛風(fēng)補(bǔ)片的定量檢測(cè)方法，為進(jìn)一步完善和提高該品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定了基礎(chǔ)。