袁遠(yuǎn)國, 黃 露, 段正鳳， 白明松， 李慧娟， 吳石平， 佘小曼

(1.貴州省園藝研究所， 貴陽 550006； 2.貴州省植物保護(hù)研究所, 貴陽 550006；3.貴州金農(nóng)科技有限責(zé)任公司， 貴陽 550006； 4.黃平縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局, 貴州 黃平 556100；5.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510640)

番茄是重要的經(jīng)濟(jì)作物，貴州常年種植面積約1.4萬hm2，外銷率70%左右，是貴州重要的外銷蔬菜。近年來，由茄科雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum(Smith) Yabuuchi)侵染引起的番茄青枯病在貴州各番茄種植基地普遍發(fā)生，連作地塊發(fā)生更為嚴(yán)重。青枯病發(fā)病時(shí)植株迅速萎蔫枯死，造成嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收。目前暫無高效、低毒、無污染的化學(xué)殺菌劑應(yīng)用于生產(chǎn)，而生物防治效果偏低、持效性短[1]，在熱帶及亞熱帶地區(qū)，青枯病是限制番茄生產(chǎn)發(fā)展的重要因素[2]。在貴州番茄主產(chǎn)區(qū)黔南布依族苗族自治州、貴陽市、安順市發(fā)現(xiàn)，許多種植戶與合作社也因?yàn)榉亚嗫莶‰y以防治、損失過大而放棄繼續(xù)生產(chǎn)。防治青枯病最根本的方法是選用抗病品種，但番茄青枯病抗性遺傳因?yàn)檎{(diào)控一些不良經(jīng)濟(jì)性狀的基因與之連鎖等問題限制了青枯病抗病育種的進(jìn)程[3]。在生產(chǎn)上，利用抗病砧木品種開展嫁接栽培是目前行之有效的綜合防治方法。據(jù)調(diào)查，貴州獨(dú)山縣、關(guān)嶺縣近年使用較廣泛的抗番茄青枯病嫁接砧木品種為廣西玉林市振興蔬菜開發(fā)部生產(chǎn)的“劉振興新一代特種砧木”，品種比較單一，抗性退化嚴(yán)重。由于茄科雷爾氏菌具有十分廣泛的寄主范圍[4]，且具有明顯的生理分化現(xiàn)象和致病性差異[5-6]，容易導(dǎo)致砧木品種的抗性喪失。應(yīng)用貴州本地番茄青枯菌株系篩選出抗病砧木品種，不僅豐富抗青枯病砧木品種資源，更有利于番茄青枯病的綜合防治。

在我國，已經(jīng)有15個(gè)省份對(duì)番茄青枯病進(jìn)行報(bào)道[7]。Xue等[8]曾報(bào)道了貴州5株番茄青枯菌株分屬演化型I，其中3株菌株為生化變種4，2株菌株為生化變種3，并明確其中1株菌株為序列變種14。徐莉莉等[9]報(bào)道，貴州分離自番茄、茄子、辣椒和煙草的22株青枯菌中有17株青枯菌屬于生化變種3，3株青枯菌屬于生化變種4，2株青枯菌屬于生化變種5。此外，番茄青枯菌生理生化及致病性相關(guān)報(bào)道較少?；诖?，本研究從獨(dú)山縣和開陽縣采集病株樣本，組織分離獲得8株番茄青枯病菌株，分析了菌株的遺傳多樣性，并應(yīng)用分離的菌株對(duì)17個(gè)番茄砧木品種進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)，為其在貴州番茄產(chǎn)區(qū)推廣應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

在獨(dú)山縣和開陽縣番茄種植青枯病嚴(yán)重發(fā)病地塊，分別隨機(jī)采集病株。對(duì)照青枯菌株Ssf-4和Hz-1，感病對(duì)照番茄品種東茄和抗病對(duì)照番茄品種LS-89，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。供試番茄砧木品種：2號(hào)、強(qiáng)根1號(hào)、強(qiáng)根3號(hào)、強(qiáng)根8號(hào)和強(qiáng)根9號(hào)(酒泉市眾禾農(nóng)業(yè)發(fā)展有限責(zé)任公司)；野生櫻桃番茄(美國引進(jìn)的野生番茄材料)；果砧1號(hào)(北京京研益農(nóng)科技發(fā)展中心)；番茄砧木1號(hào)(西安金鵬種苗公司)；千葉、薩瓦(北京育正泰種子有限公司)；ATM 053番茄砧木(沈陽克粒思豐種苗商行)；西大砧木1號(hào)(廣西大學(xué))；桂砧1號(hào)(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所)；滬砧2號(hào)(上海沃爾農(nóng)業(yè)科技有限公司)；劉振興新一代特種砧木(玉林市振興蔬菜開發(fā)部)；黔砧3號(hào)、GY 20-33(貴州省園藝研究所)。

1.2 病原菌分離

采用常規(guī)植物病原細(xì)菌組織分離法分離青枯菌[10]。切取番茄病株的莖基部或根部維管束組織約3 mm ×5 mm，在75%乙醇和0.1%升汞溶液中表面消毒各1 min，用無菌水清洗3次后用滅菌吸水紙吸干水分。在滅菌的培養(yǎng)皿中加入50 μL無菌水，將上述表面消毒處理的組織放入其中，切碎，靜置10 min。用接種環(huán)蘸取菌液在含1% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TZC)瓊脂平板劃線分離，挑取單菌落進(jìn)行純化。菌株置于無菌水中20 ℃恒溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌致病性測(cè)定

取20 ℃保存的番茄青枯菌株(分離自開陽縣的番茄青枯菌株編號(hào)分別為GZ 01～GZ 04，分離自獨(dú)山縣的番茄青枯菌株編號(hào)分別為GZ 05～GZ 08)，在含1% TZC的LB瓊脂培養(yǎng)基平板劃線上，30 ℃培養(yǎng)2 d后，選取白邊寬中間粉紅色的單菌落接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h。采用注射接種或傷根接種2種方法，將上述8株菌株分別接種番茄(東茄)、茄子(紫霸長茄)、辣椒(匯豐二號(hào))、姜(大肉姜 )、煙草(大黃煙 )和香蕉(廣東香蕉 2號(hào))等植株，測(cè)定番茄青枯病菌株對(duì)這些植物的致病性。番茄、茄子、辣椒和煙草分別接種30株，姜和香蕉分別接種15株；接種菌液的濃度為3×108CFU ·mL-1。Ssf-4菌株為對(duì)照。根據(jù)茄科雷爾氏菌生理小種劃分標(biāo)準(zhǔn)鑒定出各菌株所屬生理小種[5,11-12]。每周調(diào)查1次各處理發(fā)病情況，并從各處理中隨機(jī)取新發(fā)病植株3～5株進(jìn)行病原菌分離。接種試驗(yàn)期間網(wǎng)室內(nèi)氣溫為25～36 ℃。試驗(yàn)重復(fù)2次。

注：A為GZ 01；B為Ssf-4。

1.4 生化變種測(cè)定

生化變種的測(cè)定參照方中達(dá)[10]的方法。所用基本培養(yǎng)基成分(1 000 mL)：(NH4)H2PO41.0 g、KCl 0.2 g、MgSO4·7 H2O 0.2 g、酵母提取物0.2 g、溴百里酚藍(lán)指示劑(1.6%酒精溶液) 2 mL，pH值為7.0。將乳糖、麥芽糖、纖維二糖、甘露醇、山梨醇、甜醇分別配制成10%溶液，過濾滅菌后加入基本培養(yǎng)基至終濃度1.0%，3次重復(fù)。根據(jù)茄科雷爾氏菌生化變種劃分標(biāo)準(zhǔn)明確菌株的生化變種歸屬[13-16]。

1.5 分子特征分析

16 SrRNA序列分析：應(yīng)用細(xì)菌16SrDNA基因的通用引物27 f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1 541 r(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)[17]擴(kuò)增青枯菌的16SrDNA序列。PCR反應(yīng)體系為PremixTaq25 μL、DNA模板50 ng、引物27 f和1 541 r各6 pmol，加滅菌的雙蒸水至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?6 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，利用NCBI中BLAST程序進(jìn)行序列同源性搜索。

演化型鑒定：參照Fegan等[18]的方法測(cè)定上述8株菌株的演化型，所用PCR鑒定引物分別為Nmult:21:1 F(5′-CGTTGATGAGGCGCGCAATTT-3′)、Nmult:21:2 F(5′-AAGTTATGGACGGTGGAAGTC-3′)、Nmult:22:InF(5′-ATTGCCAAGACGAGAGAAGTA-3′)、Nmult:23:AF(5′-ATTACSAGAGCAATCGAAAGATT-3′)、Nmult:22:RR(5′-TCGCTTGACCCTATAACGAGTA-3′)以及青枯菌特異性引物759 f(5′-GTCGCCGTCAACTCACTTTCC-3′)和760 r(5′-GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG-3′)[19]。PCR擴(kuò)增體系為：引物Nmult:21:1 F、Nmult:21:2 F和Nmult:22:InF各6 pmol，Nmult:23:AF和Nmult:22:RR各18 pmol，759 f/760 r各4 pmol，PremixTaq25 μL，DNA模板50 ng，加滅菌的雙蒸水至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)?6 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃15 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取10 μL PCR 產(chǎn)物在2.5%瓊脂糖凝膠中電泳，根據(jù)帶型確定供試菌株的演化型歸屬。

序列變種鑒定：應(yīng)用引物eglF(5′-ATGCCGCTGGTTGCCGCTTCGATG-3′)和eglR(5′-TTACTTCAGGTACGGCGCCAGCAC-3′)PCR擴(kuò)增青枯菌內(nèi)葡聚糖(egl)基因，PCR擴(kuò)增采用50 mL反應(yīng)體系，其中Premix ExTaq25 μL，模版50 ng，引物Endo-F和Endo-R各6 pmol，5%DMSO。反應(yīng)程序?yàn)?6 ℃預(yù)變性9 min，94 ℃ 1 min，70 ℃ 1 min和72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸20 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。應(yīng)用MEGA-X[19]軟件對(duì)egl基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，確定菌株的序列變種。

1.6 番茄品種抗性評(píng)價(jià)

用GZ 01和GZ 05這2株菌株1∶1混合菌液接種，接種菌液濃度為1×108CFU·mL-1。采用浸根法接種番茄品種，每處理30株，4次重復(fù)，隨機(jī)排列。接種后每周調(diào)查一次，記錄各處理的發(fā)病情況。當(dāng)各處理的病情基本穩(wěn)定、無新病株出現(xiàn)時(shí)，統(tǒng)計(jì)其病株率，評(píng)價(jià)各品種對(duì)青枯病的抗性水平。番茄對(duì)青枯病的抗性標(biāo)準(zhǔn)[20]：高抗(HR)：病株率 ≤20%；抗病(R)：20%<病株率 ≤40%；耐病(MR)： 40%< 病株率 ≤60%；感病(S)：60%< 病株率。

表1 分離的青枯菌致病性測(cè)定

注：A為番茄青枯病田間癥狀；B為番茄青枯病溫室接種癥狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 青枯菌分離及培養(yǎng)性狀

在添加1% TZC的選擇性瓊脂平板上， 30 ℃培養(yǎng)72 h后，分離自番茄病株莖基部或根部維管束組織的菌落呈近圓形或梭形，隆起，中間粉紅色，周圍乳白色(圖1)。這些性狀與對(duì)照的茄科雷爾氏菌Ssf-4菌株的菌落特征一致。

2.2 致病性測(cè)定結(jié)果

分離的8株番茄青枯菌株接種健康的番茄植株7 d后，番茄植株產(chǎn)生了番茄青枯病的典型癥狀(圖2)；此外，這8株番茄青枯菌株還可侵染茄子和辣椒，弱侵染煙草和姜，不侵染香蕉。對(duì)照菌株Ssf-4可侵染番茄、茄子和辣椒，不侵染姜、煙草和香蕉。根據(jù)茄科雷爾氏菌生理小種劃分標(biāo)準(zhǔn)[5,11-12]， 8株番茄青枯菌株應(yīng)屬茄科雷爾氏菌1號(hào)生理小種(表1)。

2.3 生化變種鑒定結(jié)果

碳水化合物利用試驗(yàn)結(jié)果表明，8株番茄青枯菌株均可以利用麥芽糖、乳糖、纖維二糖、山梨醇、甘露醇和衛(wèi)矛醇等6種碳水化合物，根據(jù)茄科雷爾氏菌生化變種劃分標(biāo)準(zhǔn)[13-16]， 8株番茄青枯菌株均屬茄科雷爾氏菌生化變種3(表2)。

2.4 分子特征分析

2.4.116SrDNA序列分析

應(yīng)用細(xì)菌16SrDNA通用引物27 f和1 541 r進(jìn)行PCR，從8株番茄青枯菌株中均能擴(kuò)增出約1 500 bp特異片段。序列測(cè)定結(jié)果表明，8株番茄青枯菌株16SrDNA近全長均為1 497 bp(GenBank登錄號(hào):MT 367723～MT 367730)，序列間同源率為99.1%～100%。BLAST比對(duì)結(jié)果顯示，這8個(gè)序列與茄科雷爾氏菌R.solanacearumGMI 1 000[21](GenBank登錄號(hào)：AL 646052)16SrDNA的同源率為99.3%～99.9%。

表2 8株分離自番茄的青枯菌株的碳水化合物利用試驗(yàn)

2.4.2演化型鑒定結(jié)果

8株番茄青枯菌株及對(duì)照菌株Ssf-4均可擴(kuò)增得到144 bp的演化型Ⅰ特異條帶和280 bp的茄科雷爾氏菌特異性條帶，而對(duì)照菌株Hz-1可擴(kuò)增到280 bp 和372 bp的條帶；其中144 bp 片段為演化型Ⅰ的特異性擴(kuò)增條帶，372 bp片段為演化型Ⅱ的特異性擴(kuò)增條帶，280 bp 片段為青枯菌特異性擴(kuò)增條帶(圖3)。因此，8株番茄青枯菌株均屬茄科青枯菌演化型Ⅰ，即亞洲組。

注：M為20 bp Marker；從上往下,500 bp,400 bp,300 bp,200 bp,180 bp,160 bp,140 bp,120 bp and 100 bp；泳道1～8為GZ 01、GZ 02、GZ 03、GZ 04、GZ 05、GZ 06、GZ 07、GZ 08；泳道9為Ssf-4；泳道10為Hz-1。

2.4.3序列變種分析結(jié)果

應(yīng)用eglF和eglR引物，從8株番茄青枯菌株DNA中均能擴(kuò)增出約1 000 bp特異條帶。序列測(cè)定結(jié)果表明，8株番茄青枯菌株的egl基因部分序列長為698 bp(GenBank登錄號(hào)：MT 376744～MT 376751)。BLAST結(jié)果顯示，這8個(gè)egl基因序列與R.solanacearumGMI 1 000 菌株egl基因的同源率為98.9%～99.6%。利用MEGA X軟件將8株番茄青枯菌株與GenBank中40個(gè)青枯菌代表菌株的egl基因序列進(jìn)行進(jìn)化分析，結(jié)果(圖4)顯示，分離自開陽縣的青枯菌株GZ 01、GZ 02、GZ 03和GZ 04 屬于序列變種54，而分離自獨(dú)山縣的青枯菌株GZ 05、GZ 06、GZ 07和GZ 08屬于序列變種17。

2.5 番茄抗性評(píng)價(jià)結(jié)果

供試的17個(gè)砧木品種分別接種番茄青枯病菌(菌株GZ 01和GZ 05混合液)，接種后第5周各處理病情基本穩(wěn)定，統(tǒng)計(jì)出各處理的病株率。調(diào)查結(jié)果顯示，對(duì)照感病番茄品種東茄的病株率為96.25%，抗病番茄品種LS 89病株率為17.58%；供試17個(gè)品種中，番茄砧木1號(hào)品種病株率最高，為100%，西大砧木1號(hào)品種病株率最低，為13.66%。參照上述番茄品種對(duì)青枯病的抗性水平標(biāo)準(zhǔn)可以得出：參試的番茄砧木1號(hào)、野生櫻桃番茄、果砧1號(hào)、GY 20-33和劉振興新一代特種砧木等5個(gè)品種對(duì)番茄青枯病抗性水平表現(xiàn)為感??；強(qiáng)根1號(hào)和強(qiáng)根3號(hào)2個(gè)品種對(duì)番茄青枯病抗性水平表現(xiàn)為耐??；ATM 053番茄砧木、滬砧2號(hào)、千葉和薩瓦等4個(gè)品種對(duì)番茄青枯病抗性水平表現(xiàn)為抗??；黔砧3號(hào)、2號(hào)、強(qiáng)根9號(hào)、桂砧1號(hào)、強(qiáng)根8號(hào)和西大砧木1號(hào)等6個(gè)品種對(duì)番茄青枯病抗性水平表現(xiàn)為高抗(表3)。

表3 17個(gè)砧木品種對(duì)番茄青枯菌的抗性評(píng)價(jià)

圖4 8株分離菌株和40株青枯菌基于部分egl基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討 論

貴州番茄連作種植青枯病發(fā)病嚴(yán)重，本實(shí)驗(yàn)對(duì)兩個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的番茄青枯病病株分離菌株進(jìn)行研究，證明了引起貴州番茄青枯病的菌株屬于茄科雷爾氏菌演化型Ⅰ，1號(hào)生理小種，生化變種3，存在序列變種17和54。

茄科雷爾氏菌具有明顯的生理分化現(xiàn)象和致病性差異[5-6]。目前已有報(bào)道的番茄青枯菌存在相同的生理小種，不同的演化型、生化變種和序列變種。國外番茄青枯菌屬于茄科雷爾氏菌1號(hào)生理小種，演化型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ[4,22]，生化變種Ⅰ、2、3和4[4,23-24]，存在1、4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、18、20、29、31、35、41、38、39、46、52等22個(gè)序列變種[4,22,25-27]。而在我國已報(bào)道的番茄青枯菌屬于茄科雷爾氏菌1號(hào)生理小種[28]，演化型Ⅰ，生化變種2、3和4，存在13、14、15、16、17、18、34、44、48和54[8,28-30]等10個(gè)序列變種。本研究明確了引起獨(dú)山縣和開陽縣8株青枯菌株可侵染番茄、茄子、辣椒，弱侵染煙草和姜，不侵染香蕉，屬于茄科雷爾氏菌1號(hào)生理小種，與Xue等[8]、Xu等[28]研究結(jié)果一致。8株青枯菌株屬茄科雷爾氏菌生化變種3，與Xue等[8]曾報(bào)道分離自貴州番茄茄科雷爾氏菌屬于生化變種3和生化變種4不同，其原因可能是不同菌株間差異引起的。演化型鑒定結(jié)果和egl基因部分序列系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，8株番茄青枯菌株均屬于茄科雷爾氏菌演化型Ⅰ，該結(jié)果符合Fegan等[18]認(rèn)為的亞洲起源的茄科雷爾氏菌屬于演化型Ⅰ分類框架，同時(shí)也與我國報(bào)道的番茄青枯菌屬于茄科雷爾氏菌演化型Ⅰ的結(jié)果一致。目前國際上已經(jīng)鑒定出了63個(gè)序列變種[29]，本研究明確了分離自貴州番茄青枯病菌存在序列變種54(菌株GZ 01～GZ 04)和序列變種17(菌株GZ 05～GZ 08)。Xue等[8]曾報(bào)道分離自貴州番茄青枯菌存在序列變種14，本研究未鑒定到序列變種14的菌株，其原因可能是由于采集分離的菌株來自不同地區(qū)所引起。

番茄青枯病是番茄生產(chǎn)上重要的土傳病害，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)使番茄生產(chǎn)遭受巨大損失，迄今為止尚未找到防治番茄青枯病的有效方法，而利用抗病砧木進(jìn)行嫁接防治青枯病是最經(jīng)濟(jì)、有效、方便的措施之一。日本從美國引進(jìn)BF興津101作為砧木用于生產(chǎn)，20 世紀(jì)80 年代，日本又培育了LS 89、BFM-R、Tsueeze 等抗青枯病砧木品種[31]。我國番茄砧木的研究起步較晚，但近年來，國內(nèi)蔬菜育種單位相繼選育出優(yōu)良的番茄砧木品種，如西大砧木1號(hào)[32]、桂砧1號(hào)[33]、果砧1號(hào)[34]等。本研究進(jìn)一步應(yīng)用分離到的青枯菌菌株接種17個(gè)番茄砧木品種，篩選出高抗青枯病番茄砧木品種6個(gè)，抗青枯病番茄砧木品種4個(gè)，其中西大砧木1號(hào)和桂砧1號(hào)屬于高抗番茄青枯病，該結(jié)果與孫嵐明等[32]和黃天云等[33]報(bào)道的田間抗性一致。而鄭康等[35]認(rèn)為，桂砧1號(hào)對(duì)GMI 1000番茄青枯菌株免疫，該結(jié)果與本研究結(jié)果不同，可能是由于應(yīng)用不同番茄青枯菌株接種引起的。果砧1號(hào)是由柴敏等[36]選育出來的抗線蟲砧木，李穎儀等[34]利用果砧1號(hào)嫁接珍美番茄品種，番茄植株田間自然發(fā)病病株率在10%以下，而本研究中果砧1號(hào)對(duì)貴州番茄青枯菌株表現(xiàn)為高感，其原因可能是李穎儀等[34]利用田間栽培試驗(yàn)方法評(píng)價(jià)果砧1號(hào)抗性，而評(píng)價(jià)時(shí)由于田間土壤青枯菌分布不均勻或濃度較低導(dǎo)致田間番茄植株發(fā)病較低；而本研究利用2株不同來源青枯菌株混合液接種，增加了鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和普遍性。

本研究篩選出12個(gè)抗耐番茄青枯菌砧木品種，這些結(jié)果對(duì)于番茄青枯病防控以及抗病砧木在貴州番茄主產(chǎn)區(qū)的分布利用有著重要的指導(dǎo)意義。