苯乳酸對熒光假單胞菌基于細(xì)胞膜損傷和DNA破壞的雙靶位抑菌機(jī)制

寧亞維，侯琳琳，李明蕊，楊 正，馬夢戈，王志新，王世杰，賈英民

（1.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048）

快節(jié)奏的現(xiàn)代化生活方式導(dǎo)致市場上冷藏即食類食品數(shù)量增多，由此伴隨產(chǎn)生的因嗜冷菌污染引起的食品腐敗變質(zhì)與安全問題也日益增多。假單胞菌是一類典型的嗜冷菌，可導(dǎo)致肉制品和乳制品等多種冷藏食品發(fā)生腐敗變質(zhì)。如2010年和2011年分別在北京和長沙的肉產(chǎn)品市場中發(fā)現(xiàn)“發(fā)光豬肉”[1]，該豬肉由于熒光假單胞菌污染而產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。熒光假單胞菌會分泌蛋白酶導(dǎo)致肉產(chǎn)生黏液，極大降低了加工肉制品的品質(zhì)和安全性[2]。另外，熒光假單胞菌也是乳制品中常見的嗜冷菌[3]，分泌的堿性蛋白酶可以分解酪蛋白，導(dǎo)致乳蛋白凝固以及乳清析出，使牛乳產(chǎn)生苦味，造成乳制品品質(zhì)顯著下降[4]。熒光假單胞菌甚至可以在食品加工設(shè)備和管道中以生物膜形式存在，增強(qiáng)了嗜冷菌對加熱、消毒等傳統(tǒng)殺菌方式的耐受能力[5]。熒光假單胞菌除導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)外，還會引起諸如敗血癥、感染性休克以及血管內(nèi)凝血等疾病[6]。因此，控制熒光假單胞菌的生長對提高食品安全性以及延長食品貨架期具有重要意義。

添加防腐劑是延長食品貨架期最為常用的手段之一，目前所用的防腐劑以化學(xué)防腐劑為主，然而化學(xué)防腐劑存在安全性低、生產(chǎn)過程易于造成環(huán)境污染等問題。隨著人們對食品安全的日漸重視，生物防腐劑因具有來源天然、安全性高等優(yōu)勢而受到青睞[7]。苯乳酸即2-羥基-3-苯基丙酸，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型天然有機(jī)酸類抑菌物質(zhì)，可由乳酸菌等微生物代謝產(chǎn)生，天然存在于泡菜、酸面團(tuán)等乳酸菌發(fā)酵食品中[8]。苯乳酸具有廣譜抑菌性，可以有效抑制食源性腐敗菌和致病菌；研究發(fā)現(xiàn)苯乳酸還具有激活免疫等生理功能[9]，因此苯乳酸在食品防腐方面具有替代苯甲酸的潛在優(yōu)勢[10]。苯乳酸的抑菌機(jī)制近年來受到學(xué)者們的關(guān)注，但相關(guān)研究主要集中于食源性致病菌，如，Dieuleveux等[11]研究了苯乳酸對單細(xì)胞增生李斯特菌的抑菌機(jī)制，提出了細(xì)胞壁是苯乳酸的抑菌靶位；Wang Fengting等[12]考察了苯乳酸對糞腸球菌的抑菌機(jī)制，提出了細(xì)胞膜損傷和胞內(nèi)成分滲漏有關(guān)的抑菌機(jī)制；劉韻昕[7]研究了苯乳酸對枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌的抑菌機(jī)理，發(fā)現(xiàn)苯乳酸可以破壞菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性，同時干擾或阻斷蛋白質(zhì)、DNA的正常合成。Liu Fang等[13-14]分析了苯乳酸對陰溝腸桿菌的作用方式，發(fā)現(xiàn)苯乳酸通過破壞陰溝腸桿菌的胞質(zhì)膜，從而抑制陰溝腸桿菌的生長。本課題組基于多年來對苯乳酸的研究，發(fā)現(xiàn)苯乳酸對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有不同的抑菌機(jī)制，如苯乳酸可以破壞單細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)胞膜完整性，但對大腸桿菌的細(xì)菌膜僅破壞其滲透性，而對其完整性無顯著性損傷[15]。上述各項研究主要集中于苯乳酸對食源性致病菌的抑制方面，且研究結(jié)果顯示苯乳酸對不同指示菌的作用機(jī)制因菌株特性不同而有差異。然而，苯乳酸作為一種處于開發(fā)階段的新型抑菌物質(zhì)，有必要全面了解其抑菌機(jī)制，為進(jìn)一步工業(yè)化應(yīng)用提供充分的科學(xué)依據(jù)。因此，本研究通過考察苯乳酸對熒光假單胞菌細(xì)胞膜（包括跨膜電位、膜完整性與滲透性、菌體超微結(jié)構(gòu)等方面）、蛋白質(zhì)及DNA多靶位的抑制作用，闡釋苯乳酸對熒光假單胞菌的抑菌機(jī)制，以期為冷藏食品中嗜冷菌-熒光假單胞菌的控制以及苯乳酸在食品中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescensATCC13525）由河北科技大學(xué)食品生物技術(shù)與安全實驗室保藏。

D-苯乳酸（純度98%）、鉀離子熒光探針（PBFI acetoxymethyl ester，PBFI AM）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）探針、DiSC3(5)探針 美國Sigma公司；LIVE/DEADTM探針 美國Thermo Fisher公司；Minibest Bacterial genomic DNA Extraction Kit ver 3.0 大連寶生物有限公司；低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker、DNA Ladder北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Evolution 220紫外分光光度計 美國Thermo Scientific公司；Accuri C6 plus流式細(xì)胞儀 美國Becton Dickinson公司；BX53熒光顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社；F-7000熒光分光光度計、S-4800-I掃描電子顯微鏡 日本日立公司；170-4405EDU凝膠電泳儀、Gel DocTMXR+凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；脫色搖床TS-2000A 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；SpectraMax Plus 384酶標(biāo)儀 美國分子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 最小抑菌濃度的測定

根據(jù)Melleg?rd等[16]的方法并略作修改，采用微量二倍稀釋法利用96 孔板來測定苯乳酸對熒光假單胞菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。用新鮮的營養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基培養(yǎng)熒光假單胞菌至對數(shù)期，調(diào)整其細(xì)菌濃度為106CFU/mL備用。在96 孔板上第1列加200 μL的20 mg/mL苯乳酸溶液，第2～11列加入100 μL的NB培養(yǎng)基，從第1列吸取100 μL的苯乳酸溶液加入到第2列，吸打混勻后取100 μL加到第3列，依次重復(fù)至第10列再吸出100 μL棄掉。第11列不加苯乳酸作為陽性對照，第12列加入200 μL的NB培養(yǎng)基作為陰性對照，然后分別在第1～11列中加入100 μL的106CFU/mL菌懸液。在30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，通過酶標(biāo)儀測定吸光度，參考陰性對照，以細(xì)菌被抑制的最低苯乳酸質(zhì)量濃度為MIC。

1.3.2 時間-抑菌曲線繪制

將培養(yǎng)至對數(shù)期的熒光假單胞菌接種到NB培養(yǎng)基中，調(diào)菌液濃度為106CFU/mL。將菌懸液與不同質(zhì)量濃度的苯乳酸（0（空白對照組）、1/2 MIC、MIC、2 MIC）等體積混合，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0、2、4、6、8、12、24 h后取樣，并采用稀釋涂布平板法測定菌液中的熒光假單胞菌的活菌數(shù)。以時間為橫坐標(biāo)，活菌數(shù)的對數(shù)值為縱坐標(biāo)來繪制時間-抑菌曲線。

1.3.3 細(xì)胞膜跨膜電位的測定

使用熒光探針DiSC3(5)對熒光假單胞菌細(xì)胞的膜電位進(jìn)行測定，根據(jù)Sun Zhilan等[17]的方法并略作修改，將培養(yǎng)至對數(shù)期的熒光假單胞菌用5 mmol/L Hepes緩沖液（含有10 mmol/L葡萄糖，pH 7.2）清洗重懸，調(diào)節(jié)菌懸液濃度至2×108CFU/mL。向菌懸液中加入DiSC3(5)探針（終濃度為1 μmol/L），于30 ℃黑暗條件下孵育20 min，然后加入KCl溶液（終濃度為0.1 mol/L）平衡細(xì)胞質(zhì)內(nèi)外K+濃度。上述含K+的Hepes菌混合液與苯乳酸等體積混合，使苯乳酸終質(zhì)量濃度為0、1/2 MIC、MIC、2 MIC。分別加入尼日利亞菌素作為陰性對照，加入纈氨霉素作為陽性對照。用F-7000熒光分光光度計分別在激發(fā)波長λex＝650 nm、發(fā)射波長λem＝672 nm的條件下測定熒光強(qiáng)度。

1.3.4 細(xì)胞膜滲透性的測定

采用鉀離子敏感性探針PBFI AM考察鉀離子的泄漏情況。根據(jù)Herranz等[18]的方法，首先制備熒光假單胞菌對數(shù)期的細(xì)胞，用含5 mmol/L葡萄糖的Hepes緩沖液清洗重懸，調(diào)整菌懸液濃度為2×108CFU/mL。將PBFI AM加入到菌懸液（終濃度為2 μmol/L）中。將上述菌懸液與終質(zhì)量濃度苯乳酸（0、1/2 MIC、MIC、2 MIC）等體積混合作用0.5 h。采用熒光分光光度計分別在λex＝346 nm、λem＝505 nm條件下測定熒光強(qiáng)度，進(jìn)行3 次平行實驗。

1.3.5 細(xì)胞膜完整性的測定

取對數(shù)期的熒光假單胞菌離心，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%生理鹽水清洗重懸至菌懸液濃度為2×108CFU/mL，菌懸液與不同質(zhì)量濃度苯乳酸等體積混合，使苯乳酸終質(zhì)量濃度分別為0、1/2 MIC、MIC、2 MIC。30 ℃恒溫作用0.5 h后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%生理鹽水清洗重懸，加入PI、SYTO-9（終濃度均為1 μmol/L），30 ℃避光孵育20 min后，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%生理鹽水清洗重懸，用流式細(xì)胞儀檢測。將上述菌懸液離心后棄掉上清液，取菌體進(jìn)行顯微鏡觀察。

1.3.6 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

取對數(shù)期的熒光假單胞菌離心，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%生理鹽水清洗重懸制備為2×108CFU/mL的菌懸液。然后按Kang Shimo等[5]的方法進(jìn)行制樣，菌懸液中加入苯乳酸（0、1/2 MIC、MIC、2 MIC），在30 ℃培養(yǎng)箱中作用1 h后，采用0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液清洗3 次，用體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液固定過夜，經(jīng)0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液清洗3 次后，依次用體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、85%和90%乙醇溶液脫水，無水乙醇洗脫兩次（15 min/次）。乙酸異戊酯置換乙醇兩次（20 min/次）自然晾干除去有機(jī)溶劑。取菌體噴金后用掃描電子顯微鏡觀察菌體的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.7 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析菌體蛋白質(zhì)

取對數(shù)期的熒光假單胞菌離心，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%生理鹽水清洗重懸制備4×108CFU/mL的菌懸液。參考Lin Lin等[19]的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）方法，將菌懸液加入終質(zhì)量濃度為0、1/2 MIC、MIC、2 MIC苯乳酸。30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置作用1 h后，離心清洗收集菌體。菌懸液與4×蛋白上樣緩沖液混合，至100 ℃沸水中煮沸5 min后離心。取上清液上樣進(jìn)行SDS-PAGE，初始電壓為80 V，樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120 V，直至溴酚藍(lán)電泳至膠底。染色液染色30 min后，再用脫色液脫色直至蛋白條帶清晰，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析。

1.3.8 基因組DNA分析

收集對數(shù)期的熒光假單胞菌，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%生理鹽水清洗、重懸，制備4×108CFU/mL菌懸液。體外DNA作用方法：按照Takara試劑盒方法提取基因組DNA，與苯乳酸等體積混合使其終質(zhì)量濃度分別為0、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC和2 MIC，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱作用1 h；體內(nèi)DNA作用方法：菌懸液與不同濃度苯乳酸等體積混合，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱作用1 h后，按照Takara試劑盒方法提取基因組DNA。用超微量紫外分光光度計測定DNA純度（OD260nm/OD280nm＝1.87）以及DNA質(zhì)量濃度（40 μg/mL），進(jìn)行DNA瓊脂糖凝膠電泳（100 V、60 min），凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析。使用熒光分光光度計在激發(fā)波長280 nm、發(fā)射波長300～500 nm條件下對體外、體內(nèi)DNA熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗均重復(fù)3 次取其平均值，通過SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著，采用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯乳酸對熒光假單胞菌的抑菌活性

苯乳酸對熒光假單胞菌的MIC為1.25 mg/mL，顯著低于Kang Shimo等[5]研究的乳糖醛酸對熒光假單胞菌的MIC（12.5 mg/mL）。通過時間-抑菌曲線進(jìn)一步研究苯乳酸對熒光假單胞菌的抑菌效果。由圖1可知，空白對照組的熒光假單胞菌生長狀況良好，1/2 MIC苯乳酸組熒光假單胞菌數(shù)在前4 h輕微下降，但是4 h后隨時間延長而增加，12 h后趨于穩(wěn)定，與空白對照組相差0.56 lg（CFU/mL）。而MIC、2 MIC苯乳酸組在2 h菌落數(shù)出現(xiàn)明顯下降，6 h后活菌數(shù)趨于穩(wěn)定，作用24 h后活菌數(shù)分別降低了1.79、3.94 lg（CFU/mL），2 MIC苯乳酸抑制效果明顯優(yōu)于MIC苯乳酸。實驗結(jié)果表明1.25 mg/mL苯乳酸可以有效抑制熒光假單胞菌的生長繁殖，并且隨苯乳酸質(zhì)量濃度增大抑制效果增強(qiáng)。這與本課題組研究的MIC（1.25 mg/mL）苯乳酸作用于大腸桿菌24 h后活菌數(shù)降低將近1 lg（CFU/mL）的抑菌效果[15]相比，苯乳酸對熒光假單胞菌的抑菌效果更加顯著。

圖1 苯乳酸對熒光假單胞菌的時間-抑菌曲線Fig.1 Time-inhibition curves of PLA against P.fluoresceins

2.2 苯乳酸對熒光假單胞菌跨膜電位的影響

跨膜電位是指質(zhì)子通量引起的電化學(xué)梯度在細(xì)胞膜上產(chǎn)生的電位差[20]，DiSC3(5)是一種親脂性的熒光探針，進(jìn)入正常細(xì)胞后會在細(xì)胞脂質(zhì)層發(fā)生自我猝滅。然而當(dāng)細(xì)胞膜去極化時，DiSC3(5)會從細(xì)胞膜內(nèi)釋放出來，導(dǎo)致熒光信號增加[21]。纈氨霉素作為脂溶性抗生素可以有效破壞細(xì)胞膜上的跨膜電位[22]，而尼日利亞菌素對跨膜電位并無作用。如圖2所示，隨時間的延長，未添加苯乳酸組的DiSC3(5)熒光強(qiáng)度穩(wěn)定在170左右，1/2 MIC、MIC、2 MIC的苯乳酸作用后終熒光強(qiáng)度分別達(dá)到319.9、345.7、371.1，均高于纈氨霉素處理組，隨著苯乳酸質(zhì)量濃度的增加，DiSC3(5)熒光強(qiáng)度增大。結(jié)果表明苯乳酸可以使DiSC3(5)熒光強(qiáng)度增加，且增加程度呈劑量依賴性，導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化。不同有機(jī)酸處理的細(xì)菌均呈現(xiàn)細(xì)胞膜去極化[23]。據(jù)報道，在細(xì)胞膜去極化后，抗菌物質(zhì)很容易插入細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜形成孔隙，從而導(dǎo)致鉀離子等必需離子的泄漏[24]。Liu Guorong等[25]研究表明雙歧桿菌素A與纈氨霉素的作用效果一致，能使大腸桿菌的胞質(zhì)膜快速完全去極化。說明苯乳酸與雙歧桿菌素A均可以導(dǎo)致跨膜電位消散，使細(xì)胞膜去極化。

圖2 苯乳酸對熒光假單胞菌跨膜電位的影響Fig.2 Effect of PLA on the transmembrane potential of P.fluoresceins

2.3 苯乳酸對熒光假單胞菌細(xì)胞膜滲透性的影響

圖3 苯乳酸對熒光假單胞菌鉀離子泄露的影響Fig.3 Effect of PLA on potassium ion leakage from P.fluorescens

鉀離子通道屬于橫跨細(xì)胞膜的離子選擇性孔道，用來調(diào)控和產(chǎn)生膜電位。通過膜不滲透性的PBFI AM考察苯乳酸對熒光假單胞菌細(xì)胞內(nèi)鉀離子泄漏的影響。如圖3所示，經(jīng)過不同質(zhì)量濃度苯乳酸作用熒光假單胞菌0.5 h后，鉀離子泄露量與對照組相比均高度顯著增加（P＜0.001）。說明苯乳酸可以增大熒光假單胞菌細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致鉀離子的泄露，并且泄漏量與苯乳酸質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。這與周倩倩等[26]研究的丁香酚對熒光假單胞菌的作用效果相似，其均會通過破壞細(xì)胞膜滲透性，導(dǎo)致鉀離子泄露。與2.2節(jié)細(xì)胞膜電位的變化相對應(yīng)，苯乳酸破壞膜電勢后導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化，使平衡膜電位的鉀離子發(fā)生泄漏，進(jìn)一步驗證了苯乳酸通過破壞熒光假單胞菌的跨膜電位，增加細(xì)胞膜的滲透性。

2.4 苯乳酸對熒光假單胞菌細(xì)胞膜完整性的影響

通過SYTO-9和PI雙染法標(biāo)記細(xì)胞，采用熒光顯微鏡觀察分析苯乳酸對菌體細(xì)胞膜的損傷情況。SYTO-9能夠進(jìn)入細(xì)胞膜完整的細(xì)胞內(nèi)將核酸染色發(fā)出綠色熒光。PI可以透過破損細(xì)胞膜，而使核酸染色發(fā)出紅色熒光[27]。當(dāng)細(xì)胞膜受損，PI可進(jìn)入到細(xì)胞，對核酸進(jìn)行染色，發(fā)出紅色熒光，SYTO-9也能進(jìn)入細(xì)胞染色，但是PI的沾染能力強(qiáng)于SYTO-9，此時會產(chǎn)生熒光信號的疊加，即紅色和綠色的疊加，呈現(xiàn)紅色、橙色或黃色[22]。苯乳酸對熒光假單胞菌細(xì)胞膜完整性的影響如圖4所示，空白對照組呈綠色菌體，說明細(xì)胞膜完整；1/2 MIC苯乳酸組呈綠色、黃色和橙黃色，說明部分細(xì)胞膜有輕微破損；MIC苯乳酸組呈現(xiàn)橙黃色，說明大部分的細(xì)胞膜破損；2 MIC苯乳酸處理組呈現(xiàn)橙紅和紅色，說明2 MIC苯乳酸對膜的破壞程度明顯強(qiáng)于MIC苯乳酸。上述結(jié)果表明隨著苯乳酸質(zhì)量濃度增加，熒光假單胞菌細(xì)胞膜損傷程度增大。

圖4 苯乳酸對熒光假單胞菌細(xì)胞膜完整性的熒光顯微鏡圖Fig.4 Fluorescence microscopic images of membrane integrity of PLA-treated P.fluoresceins

為了進(jìn)一步研究細(xì)胞膜完整性的破損程度，采用流式細(xì)胞儀結(jié)合SYTO-9和PI雙染法對細(xì)胞膜完整性進(jìn)行定量研究[28]，結(jié)果如圖5、6所示。苯乳酸處理的熒光假單胞菌細(xì)胞膜完整性與空白對照組相比存在高度顯著差異（P＜0.001）。未經(jīng)苯乳酸作用的菌體僅有7.2%凋亡的細(xì)胞被PI沾染，1/2 MIC、MIC和2 MIC苯乳酸作用于熒光假單胞菌0.5 h后，細(xì)胞膜的PI沾染率分別是36.0%、57.6%、86.4%，進(jìn)一步證實苯乳酸可導(dǎo)致熒光假單胞菌細(xì)胞膜完整性受到損傷，且損傷程度與苯乳酸的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。本研究結(jié)果與Kang Shimo等[5]研究的熒光假單胞菌細(xì)胞膜損傷程度與乳糖醛酸質(zhì)量濃度呈正相關(guān)的結(jié)果相同，受試抑菌劑均可以通過劑量依賴的方式破壞細(xì)胞膜的完整性。與Liu Fang等[13]通過流式細(xì)胞術(shù)研究的苯乳酸對陰溝腸桿菌的效果類似，苯乳酸可導(dǎo)致陰溝腸桿菌的細(xì)胞膜完整性受損，但該研究所用的苯乳酸劑量較大，為10 mg/mL（相當(dāng)于本實驗中8 MIC）。與本課題組研究的苯乳酸對大腸桿菌細(xì)胞膜作用機(jī)制[15]不同，苯乳酸能夠增加大腸桿菌細(xì)胞膜滲透性，但不會破壞細(xì)胞膜完整性，而對于熒光假單胞菌，苯乳酸不僅可以增加細(xì)胞膜滲透性，還會破壞膜完整性，可能與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和組成差異有關(guān)。后續(xù)將進(jìn)一步深入研究苯乳酸對革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜損傷的差異性原因。

圖5 苯乳酸對熒光假單胞菌細(xì)胞膜完整性的流式細(xì)胞圖Fig.5 Flow cytometric analysis for of membrane integrity of PLA-treated P.fluoresceins

圖6 苯乳酸對熒光假單胞菌膜完整性的影響Fig.6 Effect of PLA on the membrane integrity of P.fluorescens

2.5 苯乳酸對熒光假單胞菌超微結(jié)構(gòu)的影響

通過掃描電子顯微鏡直觀地觀察了苯乳酸對熒光假單胞菌細(xì)胞外部超微結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果如圖7所示。空白對照組細(xì)胞呈現(xiàn)完整、清晰、飽滿并且表面相對光滑的短桿狀形態(tài)；1/2 MIC苯乳酸處理組大部分細(xì)胞仍呈正常的形態(tài)，但表面粗糙，細(xì)胞內(nèi)容物溢出發(fā)生黏連；MIC、2 MIC苯乳酸處理組菌體呈現(xiàn)嚴(yán)重破裂并引起細(xì)胞原生質(zhì)的外泄。不同質(zhì)量濃度苯乳酸對菌體破壞程度的結(jié)果與時間-抑菌曲線和流式細(xì)胞術(shù)等研究結(jié)果一致，即1/2 MIC苯乳酸處理組菌體表面與對照組差異并不明顯，熒光假單胞菌的生長未受到抑制，而MIC、2 MIC苯乳酸處理組菌體嚴(yán)重破裂，生長受到明顯抑制。說明MIC、2 MIC苯乳酸處理能夠破壞熒光假單胞菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)改變、局部破裂、原生質(zhì)泄露，從而抑制熒光假單胞菌的生長繁殖。與酸性電解水對熒光假單胞菌的作用效果[29]不同，酸性電解水作用菌體表面只發(fā)生褶皺，細(xì)胞黏連，并沒有顯著破損。與Liu Fang等[13]發(fā)現(xiàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%和0.5%苯乳酸可導(dǎo)致陰溝腸桿菌胞內(nèi)物質(zhì)泄漏的結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明苯乳酸可以破壞熒光假單胞菌細(xì)胞膜完整性和滲透性，導(dǎo)致大分子物質(zhì)泄漏。

圖7 苯乳酸對熒光假單胞菌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)掃描電子顯微鏡圖Fig.7 SEM images of the ultrastructure of P.fluoresceins cells in the presence of PLA

2.6 苯乳酸對熒光假單胞菌蛋白質(zhì)的影響

蛋白質(zhì)是生命活動的主要承擔(dān)者，干擾或抑制蛋白質(zhì)的合成可以達(dá)到抑菌作用。因此，通過蛋白質(zhì)凝膠電泳可研究苯乳酸對熒光假單胞菌中蛋白質(zhì)的影響，結(jié)果如圖8所示。與空白對照組相比，1/2 MIC、MIC、2 MIC苯乳酸處理組蛋白條帶數(shù)量無明顯變化，MIC、2 MIC苯乳酸處理組蛋白條帶的顏色變淺。結(jié)合掃描電子顯微鏡結(jié)果，推測苯乳酸嚴(yán)重破壞了熒光假單胞菌菌體，導(dǎo)致原有菌體蛋白質(zhì)發(fā)生泄漏。上述研究表明苯乳酸進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部不會改變蛋白質(zhì)的表達(dá)模式，而是通過破壞細(xì)胞膜完整性導(dǎo)致蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)泄漏。這與劉韻昕[7]研究的苯乳酸可以抑制銅綠假單胞菌蛋白質(zhì)的表達(dá)不同，推測原因可能為菌體自身抵御酸的方式不同。

圖8 苯乳酸對熒光假單胞菌細(xì)胞蛋白質(zhì)的影響Fig.8 Effect of PLA on proteins of P.fluoresceins

2.7 苯乳酸對熒光假單胞菌DNA的影響

2.7.1 苯乳酸對熒光假單胞菌體外DNA的影響

圖9 苯乳酸對熒光假單胞菌DNA體外作用的影響Fig.9 Effect of PLA on DNA of P.fluorescens in vitro

DNA是生物體內(nèi)重要的遺傳物質(zhì)，DNA的破壞會阻礙基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致正常酶和受體合成的阻滯，使菌體死亡[30]，因此本實驗考察了苯乳酸對熒光假單胞菌DNA的影響。不同質(zhì)量濃度的苯乳酸對熒光假單胞菌體外DNA的凝膠電泳結(jié)果如圖9A所示，空白對照組的DNA條帶顏色明亮，隨著苯乳酸質(zhì)量濃度的增加，DNA條帶顏色逐漸變暗，且DNA條帶位置輕微下移，說明苯乳酸可以導(dǎo)致DNA發(fā)生部分降解，分子質(zhì)量降低。而MIC、2 MIC苯乳酸處理組的條帶發(fā)生彌散，說明菌體體外DNA嚴(yán)重降解。采用熒光光譜法進(jìn)一步研究苯乳酸與DNA的相互作用[31]，如圖9B所示，熒光光譜法與瓊脂糖凝膠電泳實驗結(jié)果一致。在抑菌過程中體外DNA熒光強(qiáng)度隨苯乳酸質(zhì)量濃度升高而降低，MIC、2 MIC苯乳酸作用后的DNA體外熒光強(qiáng)度最低。研究結(jié)果與乳糖酸和香豆酸對DNA的影響不同，乳糖酸通過與熒光假單胞菌DNA結(jié)合導(dǎo)致熒光猝滅，且猝滅程度與乳糖酸質(zhì)量濃度無關(guān)[5]；香豆酸通過插入到志賀氏菌基因組DNA堿基對中，與DNA堿基相互疊加使熒光強(qiáng)度增強(qiáng)[32]?？赡苡捎谟袡C(jī)酸結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致與菌體DNA結(jié)合方式不同。由此說明苯乳酸除了作用于熒光假單胞菌細(xì)胞膜，還會與DNA結(jié)合，通過破壞DNA抑制菌體正常的生長繁殖。

2.7.2 苯乳酸對熒光假單胞菌體內(nèi)DNA的影響

盡管體外研究結(jié)果能夠說明物質(zhì)對DNA是否產(chǎn)生破壞作用，但由于受到菌體自身保護(hù)等多種作用的復(fù)雜影響，體內(nèi)DNA作用程度通常不同于體外的研究結(jié)果。因此，本節(jié)考察了不同質(zhì)量濃度苯乳酸對熒光假單胞菌體內(nèi)DNA的影響。圖10A顯示，空白對照組的DNA條帶單一且顏色明亮。隨苯乳酸質(zhì)量濃度增加，DNA條帶顏色逐漸變淺，2 MIC苯乳酸與DNA結(jié)合作用增強(qiáng)，導(dǎo)致更多DNA無法從點樣孔遷移出，出現(xiàn)輕微的阻滯現(xiàn)象。結(jié)合圖10B中熒光假單胞菌體內(nèi)DNA熒光強(qiáng)度隨苯乳酸質(zhì)量濃度增加而降低，說明經(jīng)苯乳酸作用后，熒光發(fā)生猝滅，體內(nèi)DNA含量降低。推測苯乳酸可能與DNA結(jié)合，破壞DNA構(gòu)象和結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致DNA泄露或者影響DNA正常的合成代謝。這與劉韻昕[7]研究的苯乳酸對銅綠假單胞菌體內(nèi)DNA的影響大致相同，體內(nèi)DNA的含量與苯乳酸的質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)，而且苯乳酸可以與DNA結(jié)合阻礙菌體正常的生長繁殖。結(jié)合苯乳酸對熒光假單胞菌的體外DNA實驗分析，體內(nèi)DNA猝滅程度明顯比體外DNA低，MIC苯乳酸可以使體內(nèi)DNA發(fā)生泄漏，體外DNA嚴(yán)重降解。上述現(xiàn)象可能是由于苯乳酸首先作用于細(xì)胞壁、細(xì)胞膜，然后進(jìn)入菌體內(nèi)部再與DNA發(fā)生結(jié)合，與DNA結(jié)合的苯乳酸質(zhì)量濃度可能會低于處理所用的質(zhì)量濃度，同時作用過程會受到菌體自身防御機(jī)制等因素復(fù)雜影響，因此體內(nèi)DNA的破壞程度低于體外直接作用的破壞程度。總之，本研究結(jié)果表明苯乳酸可以干擾DNA正常的合成代謝從而抑制熒光假單胞菌。此外，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)苯乳酸可以與大腸桿菌的DNA結(jié)合，影響DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而抑制菌體生長[15]。本研究進(jìn)一步明確了DNA是苯乳酸的抑菌作用靶位。

圖10 苯乳酸對熒光假單胞菌體內(nèi)DNA的影響Fig.10 Effect of PLA on DNA of P.fluorescens in vivo

3 結(jié) 論

苯乳酸可以通過破壞熒光假單胞菌的細(xì)胞膜與DNA發(fā)揮抑菌作用，即苯乳酸通過消散熒光假單胞菌的跨膜電位，增加細(xì)胞膜滲透性，造成細(xì)胞內(nèi)鉀離子顯著泄漏；通過破壞細(xì)胞膜完整性，引起細(xì)胞形態(tài)改變，導(dǎo)致內(nèi)容物泄漏、菌體發(fā)生黏連；進(jìn)入胞內(nèi)后可以破壞DNA結(jié)構(gòu)，阻礙基因的表達(dá)，從而抑制熒光假單胞菌正常的生長繁殖。該抑菌機(jī)制的闡明可為冷藏食品中天然安全生物防腐劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。