張明露，黃聰薇，黎禮科，肖一璇，余海游，趙泰然，尹 杰,*

（1.貴州大學(xué)茶學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶葉產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室，浙江 杭州 310008；3.貴州省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳，貴州 貴陽 550025；4.貴州省銅仁市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 銅仁 554300）

茶葉中含有多種礦質(zhì)元素，對茶樹生長發(fā)育和維持人體正常生命活動具有舉足輕重的作用[1]。但是，由于不同茶樹種植區(qū)土壤中元素的組成和含量，受當(dāng)?shù)氐刭|(zhì)條件、種植管理和加工方式等多種因素影響，加之茶樹對土壤中元素吸收和富集具有選擇性，使茶葉中的元素含量具有一定的地域差異[2]。隨著環(huán)境污染加劇，化肥、農(nóng)藥使用不合理、加工機械合金材料的選擇以及加工過程未實現(xiàn)清潔化生產(chǎn)等，有毒有害的重金屬元素如Pb、As、Cr、Co和稀土元素的污染對茶葉質(zhì)量安全帶來的風(fēng)險引起廣泛關(guān)注[3-4]。因此，通過分析茶葉中元素組成和含量，有利于該地茶葉質(zhì)量安全和品質(zhì)評價，了解該產(chǎn)地茶樹種植土壤條件和產(chǎn)地特征，對該地區(qū)茶樹施肥用藥、茶葉營養(yǎng)價值和飲用安全具有理論指導(dǎo)意義，同時，小范圍產(chǎn)地區(qū)域的精細(xì)判別也為茶葉質(zhì)量安全生產(chǎn)追溯提供一定的方法支持。

章劍揚等[4]對浙江省十大名茶樣品中稀土元素、As、Cr、Cd和Pb含量進(jìn)行測定，并對不同茶類間各元素含量差異和各重金屬含量之間的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果表明，所有樣品中主要重金屬含量未超出國家相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)，Cr、Cd、Pb和稀土元素含量在各類茶中差異顯著。呂海鵬等[5]分析4 個不同產(chǎn)地和不同等級的7 個曬青毛茶和25 個普洱茶中16 種礦質(zhì)元素，其中，Na、K、Ca、Zn、Mn、Fe、Al、Mg、Ni和Co共10 種礦質(zhì)元素在普洱茶中含量顯著高于曬青毛茶，不同產(chǎn)地普洱茶中K、S、Ca、Fe、Al、Mg、Ni和Co含量差異顯著，不同等級的普洱茶中礦質(zhì)元素含量則無顯著差異。但是，董喆等[6]通過測定不同季節(jié)、不同嫩度的信陽毛尖中8 種礦質(zhì)元素含量，認(rèn)為不同等級的信陽毛尖中礦質(zhì)元素含量具有一定差異性，通過主成分分析（principal components analysis，PCA）法分析其與茶葉品質(zhì)的關(guān)系，構(gòu)建可客觀評價信陽毛尖茶葉質(zhì)量的模型。同時，電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）分析法因具有快速、高效、檢出限低等優(yōu)點，較廣泛應(yīng)用于茶葉[7-9]、中藥材[10]、啤酒花[11-12]、葡萄酒[13-14]、花椒[15-16]、乳制品[17]和肉類食品[18]等產(chǎn)品中礦質(zhì)元素的檢測。

貴州省是全國茶園面積最大的省份，截止2019年底，全省茶園面積達(dá)700萬 畝，其中銅仁市位于貴州省東北部，地處我國武陵山區(qū)，是貴州省茶葉主產(chǎn)區(qū)之一，江口、思南、石阡、沿河等主產(chǎn)縣茶園面積達(dá)158萬 畝，位居貴州省第二，產(chǎn)量約占全省30%。對該市茶葉中微量元素的檢測及小范圍區(qū)域產(chǎn)區(qū)精細(xì)判別，有助于了解全省茶葉質(zhì)量安全現(xiàn)狀和開展全省茶葉產(chǎn)地追溯可行性的研究。

因此，本實驗采用ICP-MS測定銅仁市4 個主產(chǎn)縣（江口縣、石阡縣、思南縣、沿河縣）所產(chǎn)42 個綠茶茶樣中31 種微量元素含量，結(jié)合相關(guān)性分析、PCA、逐步線性判別分析（stepwise linear discriminant analysis，S-LDA）和正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）等方法，以期為該地茶葉質(zhì)量安全性、茶園肥培管理和小區(qū)域產(chǎn)地溯源等提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

共采集貴州省銅仁市4 個茶葉主產(chǎn)縣42 個綠茶茶樣（表1），所有茶樣均為2019年市售春茶，基本工藝流程為鮮葉-殺青-揉捻-（做形）-干燥。茶樣均在0 ℃條件下密封貯存。

表1 采集地相關(guān)信息和樣品數(shù)Table 1 Information about tea samples collected in this study

重金屬元素單標(biāo)鉻（Cr）、鈷（Co）、硒（Se）、鉬（Mo）、銀（Ag）、鋇（Ba）、鎳（Ni）、銅（Cu）、砷（As）、鐵（Fe）、鉛（Pb）、鋅（Zn）、鋁（Al）和錳（Mn），稀土元素單標(biāo)鈧（Sc）、釔（Y）、鑭（La）、鈰（Ce）、鐠（Pr）、釹（Nd）、釤（Sm）、銪（Eu）、釓（Gd）、鋱（Tb）、鏑（Dy）、鈥（Ho）、鉺（Er）、銩（Tm）、鐿（Yb）、镥（Lu） 國家有色金屬及電子材料分析測試中心；含有鎘（Cd）混合標(biāo)液、內(nèi)標(biāo) 美國Sigma公司；硝酸（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

X-Series 2 ICP-MS儀 美國賽默飛世爾科技公司；MARS X-Press型微波消解儀 美國CEM公司；BHW-09C趕酸器 成都英泰爾科技有限公司；超純水系統(tǒng)美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將茶樣充分磨碎，稱取0.400 g置于聚四氟乙烯微波消解管中，加入5 mL 15.2 mol/L HNO3溶液，放入微波消解儀，在180 ℃條件下消解40 min，然后在趕酸器上加熱趕酸至約1 mL，冷卻后以0.3 mol/L硝酸溶液將樣品轉(zhuǎn)移定容至25 mL，空白樣品同法處理。每個樣品做3 個平行。

1.3.2 儀器參數(shù)

ICP-MS工作條件：射頻功率1 290 W；載氣流速、輔助氣流速和補助流速分別為1.0、0.98 L/min和1.0 L/min；采樣深度8.0 mm；數(shù)據(jù)采集模式為跳峰模式；積分時間0.01 s；重復(fù)采集數(shù)據(jù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行方差分析、相關(guān)性分析和S-LDA；SIMCA-P 14.1軟件進(jìn)行PCA和OPLS-DA。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅仁市綠茶茶樣中微量元素含量分析

2.1.1 15 種微量元素含量分析

表2 銅仁市綠茶中微量元素含量Table 2 Microelements contents of green tea samples collected from different producing regions

如表2所示，比較各產(chǎn)區(qū)茶樣中15 種微量元素平均含量，其中，Al、Mn、Fe、Zn等元素含量較高，平均含量分別為707.69、646.80、143.96、50.54 mg/kg。茶樹是一種典型的富鋁植物，Al可以促進(jìn)茶樹的光合作用和生長發(fā)育、參與兒茶素類物質(zhì)的合成、影響其他元素的吸收和利用等[1]，但含量過高對人體健康具有一定的威脅。目前不同產(chǎn)地、不同茶類中Al的平均含量為175.75～2 028.60 mg/kg[2,19-20]，相比較，銅仁地區(qū)茶葉中Al含量屬于中等水平，但各產(chǎn)區(qū)之間含量差異較大。Mn、Fe和Zn不僅參與茶樹很多生理代謝過程，而且在人體維持新陳代謝、機體功能和提高免疫力等方面起著重要作用。與山東[21-22]、河南信陽[6]、江蘇[8]和浙江泰順[23]等產(chǎn)地所產(chǎn)綠茶中元素含量相比，貴州銅仁樣品中Zn含量較高，Mn和Fe含量屬中等水平；與貴州省內(nèi)安順、黔東南州雷山、黔西南州和遵義等地所產(chǎn)綠茶相比[24-25]，F(xiàn)e含量較高，Mn含量較低，Zn含量居中。除此之外，所測茶樣中還含有Cu、Ni、Co、Cr、Se、Mo等人體必需微量元素。

對所有茶樣中Cd、Pb、As、Cr和Cu等重金屬進(jìn)行測定分析后發(fā)現(xiàn)，Pb含量范圍為0.22～0.34 mg/kg，遠(yuǎn)低于GB 2762—2017《食品中污染物限量》[26]對茶葉中Pb的限量標(biāo)準(zhǔn)（≤5.0 mg/kg）；Cr、Cd和As含量范圍分別為0.36～0.67、0.032～0.083 mg/kg和0.047～0.063 mg/kg，均符合農(nóng)業(yè)部相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)（NY 659—2003《茶葉中鉻、鎘、汞、砷及氟化物限量》）[27]要求（Cr限量標(biāo)準(zhǔn)≤5.0 mg/kg、Cd限量標(biāo)準(zhǔn)≤1.0 mg/kg和As限量標(biāo)準(zhǔn)≤2.0 mg/kg）。Cu含量范圍為13.16～14.68 mg/kg，滿足農(nóng)業(yè)部規(guī)定有機茶限量（NY/T 288—2018《綠色食品 茶葉》）[28]中Cu的限量標(biāo)準(zhǔn)（≤30.0 mg/kg）。

統(tǒng)計分析結(jié)果表明，Cr、As、Se、Ba、Pb、Fe、Ni、Cu和Mn元素含量在各產(chǎn)區(qū)之間無顯著性差異（P＞0.05），其余6 種元素（Co、Mo、Ag、Cd、Zn和Al）含量在不同產(chǎn)區(qū)茶樣之間差異顯著（P＜0.05）。其中，Co和Mo含量由高到低依次為思南縣、石阡縣、沿河縣、江口縣，Mo的最高含量與最低含量間相差21.51 倍；Ag含量則為江口縣＞沿河縣＞思南縣＞石阡縣，江口縣樣品中的平均含量與石阡縣樣品中的平均含量相差6.5 倍；Cd含量依次為思南縣＞沿河縣＞石阡縣＞江口縣；Zn含量為江口縣＞石阡縣＞沿河縣＞思南縣；Al含量則為思南縣＞江口縣＞石阡縣＞沿河縣。

2.1.2 稀土元素含量分析

表3 銅仁市綠茶中稀土元素含量Table 3 Rare element contents of green tea samples collected from different producing regions

從表3可知，42 個綠茶茶樣中各稀土元素含量范圍為0.001～0.118 mg/kg，各稀土元素總量由高到低分別為Ce、La、Y、Nd、Sc、Pr、Gd、Sm、Dy、Eu、Er、Yb、Ho、Tb、Tm和Lu，表明茶樹對稀土富集具有選擇性，以Ce、La、Y、Nd和Sc積累為主，與王雪萍[29]、方志清[30]等的研究結(jié)果一致。4 個產(chǎn)地茶樣中稀土總含量為1.36 mg/kg，與冉登培等[24]檢測結(jié)果相近（1.442 mg/kg），從高到低分別為沿河縣、思南縣、石阡縣和江口縣，其中，江口縣、石阡縣和思南縣的茶樣中未檢測出Tm和Lu元素，同時，江口縣的茶樣也未檢測出Tb元素。統(tǒng)計分析表明，Ce、La和Eu元素在各產(chǎn)區(qū)茶樣之間不存在顯著差異（P＞0.05），其余13 種稀土元素含量在不同產(chǎn)區(qū)茶樣之間差異顯著（P＜0.05），說明茶葉中稀土元素的組成與其種植環(huán)境地質(zhì)密切相關(guān)，茶園土壤是茶葉中稀土元素主要來源之一[31]。

2.2 元素相關(guān)性分析

圖1 不同產(chǎn)區(qū)綠茶中31 種元素之間的相關(guān)性熱圖Fig. 1 Heat map showing correlation between 31 elements in green tea samples collected from different producing regions

對茶樣中31 種微量元素進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析（圖1），16 種稀土元素中，除Sc外，其余15 種稀土元素相互之間呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)關(guān)系，說明這些元素之間具有較強的協(xié)同作用。除稀土元素以外的15 種微量元素中，Pb、As、Cr、Fe和Al與其他元素之間只存在極顯著正相關(guān)或顯著正相關(guān)；Ba與Mn、Cd和部分稀土元素；Se與Zn和Cd；Ag與Se和Zn；Ni、Cu和Zn之間；Cd與Mn、Mo和Co；Co與Mn、Mo都存在正相關(guān)或顯著正相關(guān)。表明茶樹在富集上述元素時，元素之間具有一定的協(xié)同、相互促進(jìn)吸收的關(guān)系。

另外，15 種稀土元素（除Sc外）與Zn和Ni；S與Se；Co與大部分稀土元素；Ag與Cd、Co和Mo；Ni與Mn和Ba；Cu與Tm、Lu、Tb和Eu；Zn與Cd、Mo、Ba和Mn存在負(fù)相關(guān)或顯著負(fù)相關(guān)，揭示這些元素之間呈現(xiàn)相互抑制、拮抗的關(guān)系。

2.3 銅仁市綠茶溯源分析

2.3.1 PCA結(jié)果

圖2 基于PCA前3 個PC構(gòu)建的綠茶樣品散點圖Fig. 2 Three-dimensional PCA scatter plot of first three principle components for green tea samples

PCA通過線性變換進(jìn)行降維處理，以較少的指標(biāo)反映盡可能多的信息，并對具有代表性的PC數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化[14,32]。對樣品中具有顯著差異的19 種元素（P＜0.05）進(jìn)行PCA，選取特征值大于1的成分作為PC，結(jié)果表明，前4 個PC（PC1～PC4）的方差貢獻(xiàn)率分別為60.30%、14.49%、10.68%、6.26%，累計方差貢獻(xiàn)率達(dá)到91.73%，能夠達(dá)到充分反映原始數(shù)據(jù)信息的目的。PC1主要由Lu、Y、Tb、Ho、Tm和Yb元素構(gòu)成，PC2主要由Co和Mo元素構(gòu)成，PC3主要由Co、Ag、Lu、Al和Cd元素構(gòu)成。以PC1、PC2和PC3的得分作3D圖，從圖2可以看出，各個產(chǎn)區(qū)的樣品有聚類的趨勢，但是除了江口縣的樣品可區(qū)分，其余3 個產(chǎn)區(qū)的樣品均有重疊現(xiàn)象。表明用PCA構(gòu)建模型未能將這4 個產(chǎn)區(qū)的樣品有效區(qū)分，但利用特征元素進(jìn)行茶葉小區(qū)域產(chǎn)地溯源是可行的。

2.3.2 S-LDA結(jié)果

采用S-LDA對4 個產(chǎn)區(qū)綠茶元素含量進(jìn)行判別分析。選取19 種具有顯著差異性的元素（P＜0.05）作為變量納入模型，結(jié)果表明，其中7 種元素（Sc、Ag、Cd、Tm、Yb、Zn、Al）被判別模型保留作為判別指標(biāo)，同時，根據(jù)Wilks’λ值構(gòu)建了3 個判別函數(shù)。這3 個函數(shù)解釋了100%變異（判別函數(shù)F1、F2和F3分別解釋了所有變異的62.1%、25.7%和12.2%）。典型相關(guān)系數(shù)分別為0.923、0.838和0.728，類間差異顯著（p1、p2和p3均小于0）[2]，表明判別結(jié)果有效。基于所選7 個元素構(gòu)建判別函數(shù)如下：

圖3 基于S-LDA前2 個PC構(gòu)建的綠茶樣品散點圖Fig. 3 S-LDA scatter plot of first two principal components for green tea samples

利用判別函數(shù)F1和F2對4 個產(chǎn)地的樣品分類，如圖3所示，4 個產(chǎn)區(qū)的樣品基本可以區(qū)分開，江口縣、思南縣和石阡縣相互之間可以完全區(qū)分，但沿河縣與思南縣和石阡縣有小部分重疊。進(jìn)一步將這7 種元素作為判別指標(biāo)，采用正交驗證法對判別模型進(jìn)行驗證，結(jié)果見表4，對42 個已知樣本的回判正確率為90.5%，交叉驗證成功率為83.3%，可將這7 種元素作為該4 個產(chǎn)地識別的判斷指標(biāo)。4 個產(chǎn)地的Fisher線性判別式函數(shù)如下：

表4 S-LDA對不同產(chǎn)區(qū)銅仁綠茶產(chǎn)地溯源的判別結(jié)果Table 4 Correct discrimination rates of green tea samples from different producing regions in Tongren city by S-LDA model

2.3.3 OPLS-DA結(jié)果

對于樣本量小和自變量較少的數(shù)據(jù)，采用OPLSDA具有一定優(yōu)勢。以19 種具有顯著差異的元素（P＜0.05）含量作為特征變量建立統(tǒng)計模型，統(tǒng)計量分別為說明97%的變量可解釋73.7%的組間差異；Q2=0.617，證明該模型具有較好的預(yù)測能力（R2和Q2均大于0.5）。變量對變異權(quán)重參數(shù)（variable importance in projection，VIP）值如圖4所示，VIP值可以量化每個變量對分類的貢獻(xiàn)，VIP值越大（＞1），對地域判別的差異性越顯著[33]，6 種元素（Mo、Lu、Al、Ag、Tm和Co）的VIP值大于1，說明上述6 種元素在4 個產(chǎn)區(qū)樣品中具有顯著差異，尤其是Mo、Lu和Al的VIP值分別為1.776、1.586和1.493，表明這3 種元素可作為4 個產(chǎn)區(qū)樣品鑒別的特征元素。不同區(qū)域綠茶樣本散點圖如圖5所示，4 個產(chǎn)區(qū)的樣品中，思南縣和沿河縣的樣品仍有小部分重疊，表明這2 個產(chǎn)區(qū)可能具有相似的地質(zhì)條件、生態(tài)氣候和茶園栽培管理方法，后續(xù)可進(jìn)一步探究這2 個產(chǎn)區(qū)茶園土壤、茶樹品種等的異同性。該方法的正確判別率為92.86%（表5），其中，石阡縣的茶樣判別率為100%，高于S-LDA法的85.7%（表4），表明該模型的準(zhǔn)確度較高。

圖4 19 種具有顯著差異元素的VIP值Fig. 4 Variable importance in the projection (VIP) obtained from the OPLS-DA mode

圖5 前2 個PC的OPLS-DA得分圖Fig. 5 OPLS-DA score plot of first two principle components

表5 OPLS-DA對不同產(chǎn)區(qū)銅仁綠茶產(chǎn)地溯源的判別結(jié)果Table 5 Correct discrimination rates of green tea samples collected from different producing regions in Tongren city by OPLS-DA model

3 結(jié) 論

貴州省銅仁市江口縣、石阡縣、思南縣和沿河縣的42 個綠茶茶樣中Al、Mn、Fe和Zn等元素含量較高；Cd、Pb、As、Cr和Cu等重金屬含量較低，均未超出國家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)限量值；樣品中的稀土元素總量較低，其中，江口縣樣品未檢出Tm、Lu和Tb，石阡縣和思南縣的茶樣中未檢測出Tm和Lu元素。

根據(jù)相關(guān)性分析表明，此次所測定的31 種微量元素之間存在相互協(xié)同或者拮抗的關(guān)系，特別是稀土元素之間存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，說明在茶樹生長過程中，這些元素的吸收和利用是相互影響的，其相互作用的原理有待進(jìn)一步研究。

利用PCA、S-LDA和OPLS-DA對4 個產(chǎn)區(qū)的樣品進(jìn)行判別，結(jié)果表明PCA無法有效區(qū)分4 個產(chǎn)區(qū)樣品；S-LDA判別正確率為90.5%，交叉驗證準(zhǔn)確判別率為83.3%；OPLS-DA的判別最佳，正確率為92.86%，由此說明元素含量測定結(jié)合多元統(tǒng)計分析可有效實現(xiàn)茶葉小范圍產(chǎn)地區(qū)域的正確區(qū)分。其中，采用S-LDA方法對江口縣和思南縣的判別準(zhǔn)確率可達(dá)到100%，OPLS-DA則可將江口縣和石阡縣的樣品100%準(zhǔn)確識別。因此，可進(jìn)一步結(jié)合S-LDA與OPLS-DA，篩選貢獻(xiàn)率較大的指標(biāo)構(gòu)建新的模型，提高判別準(zhǔn)確率，為茶葉小區(qū)域溯源及質(zhì)量安全可追溯性提供一定的理論依據(jù)。