超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜測定白酒中氨基甲酸乙酯含量

熊曉通，胡 峰，尤小龍，尹艷艷，陳明學(xué)，程平言，鐘方達(dá)

（貴州茅臺酒廠（集團(tuán)）習(xí)酒有限責(zé)任公司，貴州 習(xí)水 564622）

近年來，隨著醬酒熱的持續(xù)升溫，醬香型白酒也越來越受到消費者的青睞[1-2]。而氨基甲酸乙酯（ehthy carbamate，EC）作為醬香白酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一種天然有害致癌物質(zhì)[3]，在各種香型白酒中均普遍存在[4]，雖在白酒領(lǐng)域已取得了釀造過程中EC產(chǎn)生機理的研究成果[5-6]，并針對一些工藝環(huán)節(jié)實施了對EC含量的控制[7-8]，但因人工干預(yù)環(huán)節(jié)的有限性，仍然難以徹底杜絕EC的安全隱患[9]，并且根據(jù)國內(nèi)外相關(guān)研究，白酒中的主要成分乙醇也會加大EC的致癌性[10]，故EC產(chǎn)生的食品安全風(fēng)險隱患已成為白酒行業(yè)關(guān)注的熱點問題之一[11-14]。雖然國內(nèi)暫未出臺EC的相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)，但加拿大、捷克、法國等國家早已規(guī)定蒸餾烈酒中EC質(zhì)量濃度不得超過150 μg/L[15-17]。

目前，薄層分析法[18]、液相色譜法[19]、氣相色譜分析法[20]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[21]、近紅外光譜法[22]等是常用的EC檢測方法。上述幾種方法存在樣品前處理過程繁瑣、需要消耗大量藥品和有機溶劑、基質(zhì)干擾較大、樣品檢測效率不高等缺點，不利于人體健康、環(huán)境和檢測成本控制[23]。隨著檢測設(shè)備的不斷更新?lián)Q代，新的檢測技術(shù)也被廣泛應(yīng)用[24-25]，其中超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜檢測技術(shù)檢測醬香白酒中EC含量時具有前處理方便快捷、基質(zhì)效應(yīng)較低、抗干擾能力強、分辨率高、靈敏度高、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點，國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報道也并不多見[26-27]。因此，本研究擬建立醬香白酒中EC含量的超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜一級子離子定量法，該方法旨在有效去除基質(zhì)干擾，靈敏度高，檢測分析速度較快，在醬香白酒EC監(jiān)控過程中取得良好效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗酒樣為貴州茅臺酒廠（集團(tuán)）習(xí)酒有限責(zé)任公司醬香成品酒以及市購醬香型白酒。

EC標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.5%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇、甲酸（均為色譜純） 美國Fisher公司；實驗用水均為艾科浦超純水機制備的超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Q Exactive Focus高分辨質(zhì)譜儀（配備可加熱電噴霧電離源） 美國Thermo公司；UltiMate 3000超高效液相色譜儀 美國Dionex公司；萬分之一電子天平美國Ohaus公司；BPG型精密鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；渦旋振蕩器 上海琪特分析儀器有限公司；全智能超純水機 美國艾科浦公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取一定量EC標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，加水定容后配制成質(zhì)量濃度為122 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，并放置于4 ℃冰箱中貯存待用。

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：準(zhǔn)確量取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100 mL容量瓶中，加水定容后配制成質(zhì)量濃度為1 220 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液，再逐級稀釋至12.2、36.6、61、122、244 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，并放置于4 ℃冰箱中貯存，待用。

1.3.2 樣品前處理

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液前處理：系列溶液過0.22 μm水相微孔濾膜后直接上機檢測。

酒樣前處理：準(zhǔn)確吸取1 mL酒樣于離心管中，置于80 ℃烘箱中烘至0.2～0.4 mL后取出，冷卻后加水定容至1 mL，渦旋混勻，過0.22 μm水相微孔濾膜，上機檢測。

1.3.3 分析條件

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：Accucore aQ液相色譜柱（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）；柱溫：35 ℃；流動相：A相為體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸溶液，B相為甲醇；進(jìn)樣溫度：4 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；洗脫方式：采用梯度洗脫（表1）。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：可加熱大氣壓電噴霧電離源，正離子掃描模式；掃描類型：選擇離子檢測模式；掃描范圍m/z55～95；分辨率70 000；自動增益控制目標(biāo)離子數(shù)1×106；最大注入時間5 ms；鞘氣流速30 arb；輔助氣流速15 arb；噴霧電壓2.3 kV；離子傳輸管溫度350 ℃；S-lens RF evel：80；輔助氣加熱溫度200 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 子離子的確定

王成龍等[28]以m/z62.02作為EC的定量子離子，運用高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜儀建立了平行反應(yīng)監(jiān)測二級子離子全掃描模式，對白酒中EC進(jìn)行二級子離子定量。本研究運用一級全掃自動觸發(fā)二級模式對122 μg/L EC標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，得到EC的一級母離子色譜圖（圖1），發(fā)現(xiàn)若采用一級母離子定量，其基質(zhì)干擾較為嚴(yán)重，檢出限較高。EC母離子在高能量碰撞解離池中，被10 eV的碰撞能量打碎后，提取出EC的二級質(zhì)譜圖（圖2），雖然m/z62.02的相對豐度最大，但響應(yīng)值也只有1.78×104。在相同色譜條件下，運用平行反應(yīng)監(jiān)測二級子離子全掃描模式高能量碰撞解離池（碰撞能量為10 eV）對122 μg/L EC標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，將圖2中離子進(jìn)行逐個提峰，僅m/z62.02的離子所提取的峰（圖3）與圖1匹配效果較好，若采用二級子離子定量，雖消除了基質(zhì)干擾，但其響應(yīng)值較低，僅為5.24×104。

圖1 122 μg/L EC標(biāo)準(zhǔn)溶液一級母離子色譜圖Fig. 1 Primary parent ion chromatogram of EC standard solution at 122 μg/L

圖2 122 μg/L EC標(biāo)準(zhǔn)溶液二級質(zhì)譜圖Fig. 2 Secondary mass spectrum of EC standard solution at 122 μg/L

圖3 122 μg/L EC標(biāo)準(zhǔn)溶液二級子離子色譜圖Fig. 3 Secondary daughter ion chromatogram of EC standard solution at 122 μg/L

圖4 EC母離子生成m/z 62.02離子模擬裂解圖Fig. 4 Simulated fragmentation of EC parent ions into m/z 62.02

據(jù)相關(guān)報道，m/z62.02的碎片離子為[EC＋H]+脫掉C2H4基團(tuán)后形成的[29]，為進(jìn)一步確認(rèn)m/z62.02的碎片離子為EC的子離子，本研究使用Mass Frontier 7.0 軟件對EC母離子進(jìn)行了模擬裂解，得到了生成m/z62.02離子的3 種可能途徑（圖4）。因此，m/z62.02的離子為EC的特征子離子，這與王成龍等[28]的研究報道一致。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

為解決一級母離子定量基質(zhì)干擾嚴(yán)重和二級子離子定量響應(yīng)較低問題，本研究使用進(jìn)樣針吸取一定量122 μg/L EC標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μL/min）與流動相（45%的A相、55%的B相，0.05 mL/min）通過三通閥混合后經(jīng)離子源直接進(jìn)質(zhì)譜進(jìn)行一級全掃，得到優(yōu)化前的一級質(zhì)譜圖（圖5A），發(fā)現(xiàn)EC出現(xiàn)源內(nèi)裂解現(xiàn)象，同時出現(xiàn)m/z90.05的母離子以及m/z62.02的特征碎片子離子，這為EC一級子離子定量的可行性提供了依據(jù)。通過調(diào)節(jié)質(zhì)譜參數(shù)以提高m/z62.02子離子的響應(yīng)值，從而確定了最大注入時間、S-lens RF level兩個主要影響因素。通過降低最大注入時間和提高S-lens RF level參數(shù)可明顯增加子離子的響應(yīng)值，其余參數(shù)均使用儀器默認(rèn)值或廠家推薦值，從而確定1.3.3.2節(jié)優(yōu)化后的質(zhì)譜條件，繼而得到優(yōu)化后的一級質(zhì)譜圖（圖5B）。其中m/z62.02子離子優(yōu)化前的響應(yīng)值為4.52×105，經(jīng)優(yōu)化后變?yōu)?.50×106，提高了2.32 倍。相較于二級掃描模式下，m/z62.02子離子響應(yīng)值提升了2 個數(shù)量級。

圖5 EC質(zhì)譜條件優(yōu)化前（A）、后（B）一級質(zhì)譜圖Fig. 5 Primary mass spectra of EC before (A) and after (B)optimization of mass spectral conditions

2.3 色譜條件選擇

采用1.3.3.2節(jié)的質(zhì)譜參數(shù)，在0.1%甲酸溶液-甲醇的流動相體系下，分別考察SyncronisHilic色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Hypersil GOLD Amino色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）以及Accucore aQ色譜柱（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）對EC分離效果的影響（圖6）。結(jié)果表明，同一濃度EC標(biāo)準(zhǔn)溶液在SyncronisHilic柱中出峰時間為1.13 min，保留時間較短，容易受基質(zhì)干擾影響。在Hypersil GOLD Amino柱中雖有一定保留，但響應(yīng)值較低，靈敏度不高。在Accucore aQ柱中不僅保留時間較長，響應(yīng)值也較高，取得較好的分析效果。因此，選擇Accucore aQ色譜柱作為分析柱。

圖6 不同色譜柱下122 μg/L EC標(biāo)準(zhǔn)溶液一級子離子色譜圖Fig. 6 Primary daughter ion chromatograms of EC standard solution at 122 μg/L using different columns

2.4 方法評價

2.4.1 線性范圍、檢出限和定量限

本實驗根據(jù)醬香白酒中EC的實際含量確定1.3.1節(jié)中的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按1.3.3節(jié)的分析條件對標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行上機檢測，以EC質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性擬合，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=3 788.24＋67 210X，R2=0.999 5，線性范圍12.2～244 μg/L。以信噪比為3和10分別確定方法的檢出限和定量限，檢出限為0.95 μg/L，定量限為3.17 μg/L。

2.4.2 回收率和精密度實驗結(jié)果

分別選取38%、42%、53%的醬香型白酒，加標(biāo)量為10、50、100 μg/L，在1.3.3節(jié)分析條件下，對加標(biāo)樣品進(jìn)行前處理后上機檢測。每個加標(biāo)樣品做6 次平行實驗，計算樣品回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），不同乙醇體積分?jǐn)?shù)的醬香型白酒加標(biāo)回收率在83.46%～106.79%之間；對此方法的精密度進(jìn)行考察，其中EC測定結(jié)果RSD為0.67%～3.54%，均小于5%，完全符合方法精密度要求，結(jié)果如表2所示。

表2 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)醬香型白酒加標(biāo)回收率和RSD（n=6）Table 2 Recoveries and relative standard deviation of EC in spiked Maotai-flavor Baijiu with different alcohol contents (n= 6)

2.5 實際樣品的測定結(jié)果

選取不同品牌市售的53%醬香型白酒進(jìn)行分析檢測，每個酒樣重復(fù)檢測6 次，均不同程度檢出了EC，平均質(zhì)量濃度為105.25 μg/L，測定結(jié)果RSD均小于5%，結(jié)果如表3所示。

表3 不同品牌醬香型白酒中EC含量（n=6）Table 3 EC contents in different brands of Maotai-flavor Baijiu (n= 6)

3 結(jié) 論

本研究運用EC在高分辨質(zhì)譜儀一級全掃模式下出現(xiàn)源內(nèi)裂解的性質(zhì)，建立了檢測醬香型白酒中EC含量的超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜一級子離子定量法。該方法不僅解決了一級母離子定量基質(zhì)干擾嚴(yán)重、檢出限較高的問題，還克服了二級子離子定量響應(yīng)較低的難題。方法前處理也相對簡單，酒樣僅需烘箱內(nèi)揮發(fā)除乙醇后定容即可，測定過程在10 min內(nèi)便可完成，具有分析速度快、響應(yīng)值高、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點。醬香型白酒餾酒溫度高，部分產(chǎn)品尤其是高端產(chǎn)品中EC含量較低[30-31]，本方法檢出限為0.95 μg/L，定量限為3.17 μg/L，可以滿足應(yīng)用于EC含量較低的醬香型白酒產(chǎn)品EC的定量測定，最大限度降低EC產(chǎn)生的食品安全風(fēng)險，同時高效便捷的實驗步驟可實現(xiàn)醬香型白酒產(chǎn)品中EC的大量檢測。