熊永嶗，蔡桂豐，楊桂艷，周雯雯，梁曉燕

(1.珠海市婦幼保健院生殖中心，珠海 519000；2.中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖中心，廣州 510000)

近年來，輔助生殖技術(shù)(ART)取得了明顯進(jìn)步，但胚胎種植率低仍然困擾著臨床醫(yī)師和患者，這是IVF-ET成功的最大障礙。胚胎種植失敗在IVF-ET失敗原因中的占比超過50%[1]。確保胚胎成功種植在子宮內(nèi)膜上，是IVF-ET成功的關(guān)鍵一步。胚胎種植過程復(fù)雜，涉及胚胎與子宮內(nèi)膜間的分子聯(lián)系。IVF-ET過程中胚胎種植的影響因素主要涉及子宮內(nèi)膜容受性、胚胎質(zhì)量，而宮腔內(nèi)HCG在其中發(fā)揮著重要作用。HCG與內(nèi)膜的受體結(jié)合后可調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的容受性和胚胎種植過程[2]，且該受體廣泛存在于子宮內(nèi)膜的腺體細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞上[3]。目前相關(guān)的研究主要集中在第3天胚胎解凍前進(jìn)行HCG宮腔灌注的研究，未見關(guān)于凍融囊胚移植前行宮腔灌注的報(bào)道。有研究提示HCG過早暴露可能降低內(nèi)膜的容受性[4]，在囊胚移植前行HCG宮腔灌注，內(nèi)膜暴露于HCG時(shí)間短，HCG對(duì)內(nèi)膜容受性的影響可能更佳，更有利于囊胚著床。因此，本研究回顧性分析因反復(fù)種植失敗再次行凍融囊胚移植患者的臨床資料，旨在探討凍融囊胚移植前行HCG宮腔灌注在反復(fù)種植失敗患者助孕治療中的效果。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2018年1月至2019年12月在珠海市婦幼保健院生殖中心就診，因反復(fù)種植失敗再次行凍融囊胚移植患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：3次以上胚胎移植或累計(jì)移植超過4枚優(yōu)質(zhì)胚胎均未能成功受孕；女方年齡24～40歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并急性盆腔炎、輸卵管積水、各種陰道炎、術(shù)前體溫超過37.3℃等。

本研究最終納入160例患者，根據(jù)凍融囊胚移植前是否進(jìn)行HCG宮腔灌注分為灌注組(移植前給予HCG宮腔灌注，n=52)和未灌注組(n=108)。

二、研究方法

1.宮腔灌注方法：宮腔灌注時(shí)間在凍融囊胚移植前24 h。常規(guī)外陰陰道消毒并鋪巾，1 ml注射器連接COOK一次性移植外管，抽吸0.5 ml生理鹽水溶解HCG(人絨毛膜促性腺激素，2 000 U/支，珠海麗珠)500 U，緩慢注入宮腔。宮腔灌注后囑患者臥床30 min，讓藥物涂布宮腔。

2.內(nèi)膜準(zhǔn)備方案：自然周期方案：月經(jīng)第10天監(jiān)測(cè)排卵，確定排卵日定義為第1天，排卵后第5天為囊胚移植日；人工周期方案：月經(jīng)第5天開始口服補(bǔ)佳樂(戊酸雌二醇，拜耳，德國)3 mg，2次/d，根據(jù)內(nèi)膜厚度可調(diào)整至4 mg，2次/d。在用藥過程中監(jiān)測(cè)內(nèi)膜厚度，當(dāng)用藥時(shí)間達(dá)8 d以上，子宮內(nèi)膜厚度達(dá)到7 mm以上肌肉注射黃體酮(黃體酮注射液，浙江仙琚)6 mg，每日一次。肌肉注射黃體酮第6天為囊胚移植日。

3.凍融囊胚移植：所有囊胚均采用玻璃化法進(jìn)行冷凍和復(fù)蘇，復(fù)蘇后的囊胚在培養(yǎng)1～3 h后，進(jìn)行Gardner評(píng)分。在實(shí)時(shí)B超監(jiān)測(cè)下，將移植外導(dǎo)管沿宮頸外口位置輕輕置入到宮頸內(nèi)口水平；當(dāng)外管置入困難，可考慮使用金屬內(nèi)芯協(xié)助。將裝載有囊胚的內(nèi)芯導(dǎo)管通過外套管置入宮腔內(nèi)，距宮底0.5～1.0 cm推注射器注入囊胚。

4.黃體支持和妊娠判斷：自然周期黃體支持采用肌肉注射黃體酮20 mg；人工替代周期采用口服補(bǔ)佳樂3～4 mg，2次/d和肌肉注射黃體酮60 mg，黃體支持至移植后8周。囊胚移植后12 d測(cè)血清HCG確定妊娠，陽性者移植后23 d行B超檢查，若宮內(nèi)宮外均無孕囊者確定為生化妊娠；B超檢查顯示孕囊者確定為臨床妊娠，并確定妊娠胎數(shù)?；町a(chǎn)是指孕24周后有活胎分娩，流產(chǎn)是指孕24周之前臨床妊娠丟失。

5.觀察指標(biāo)：比較兩組患者的年齡、體重指數(shù)(BMI)、不孕年限、FSH、LH、E2、取卵周期數(shù)、移植周期數(shù)、既往移植胚胎數(shù)、內(nèi)膜厚度、移植囊胚數(shù)、生化妊娠率、臨床妊娠率、囊胚種植率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率及移植日子宮內(nèi)膜厚度。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、患者基本資料

兩組患者的年齡、BMI、不孕年限、FSH、LH、E2、取卵周期數(shù)、移植周期數(shù)、既往移植胚胎數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者的基本資料比較(-±s)

二、凍融囊胚移植前內(nèi)膜準(zhǔn)備情況和囊胚移植情況

灌注組內(nèi)膜準(zhǔn)備方案采用人工周期方案和自然周期方案的患者分別是32例和20例，未灌注組采用人工周期方案和自然周期方案的患者分別是64例和44例；兩組患者移植日平均子宮內(nèi)膜厚度及平均移植囊胚數(shù)比較均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

三、兩組患者的妊娠結(jié)局比較

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，灌注組患者的活產(chǎn)率、臨床妊娠率、囊胚種植率以及生化妊娠率均顯著高于未灌注組(P<0.05)；而兩組間流產(chǎn)率比較無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表2 兩組移植日內(nèi)膜厚度及移植囊胚數(shù)比較(-±s)

表3 兩組患者的妊娠結(jié)局比較(%)

討 論

控制性促排卵方案、實(shí)驗(yàn)室胚胎培養(yǎng)和移植技術(shù)的不斷優(yōu)化使得IVF-ET的臨床妊娠結(jié)局獲得了進(jìn)一步的改善，但是反復(fù)種植失敗仍然是IVF-ET最大的難題之一[5]。引起胚胎種植失敗的原因是多方面的，主要包括宮腔內(nèi)膜薄、宮腔粘連、子宮內(nèi)膜炎、內(nèi)膜與胚胎發(fā)育不同步、免疫排斥反應(yīng)等。通過改善內(nèi)膜容受性、加強(qiáng)內(nèi)膜與胚胎同步化以及降低內(nèi)膜的免疫排斥反應(yīng)可以有效提高胚胎的種植率[6]。

有文獻(xiàn)報(bào)道，反復(fù)種植失敗與母胎界面的免疫失衡相關(guān)，即子宮內(nèi)膜局部存在免疫異常[7]。HCG是胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的激素，可以促進(jìn)胚胎的種植。HCG宮腔灌注可以誘導(dǎo)白血病抑制因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶P的激活，同時(shí)抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1和巨細(xì)胞集落刺激因子的激活[8]。另外，HCG可以通過調(diào)控這些因子通路增加子宮內(nèi)膜容受性。HCG通過激活基質(zhì)金屬蛋白酶從而加速滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)子宮內(nèi)膜的浸潤。內(nèi)膜容受性增加也提高了不良胚胎的種植，不良胚胎在早期停止發(fā)育導(dǎo)致生化妊娠，不會(huì)對(duì)患者造成明顯傷害。細(xì)胞免疫在囊胚著床過程中起著重要的作用。HCG能夠吸引調(diào)節(jié)T細(xì)胞，保持TH1和TH2效應(yīng)細(xì)胞的平衡，有利于母體-胎兒免疫耐受。此外，HCG還可以增加自然殺傷細(xì)胞的數(shù)量、抑制巨細(xì)胞的遷移來調(diào)節(jié)母體-胎兒的免疫反應(yīng)[9]。

HCG是由胎盤的滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的一種二聚體糖蛋白，包含α和β兩個(gè)亞單位。研究發(fā)現(xiàn)HCG宮腔灌注可促進(jìn)肌動(dòng)蛋白α2和其編碼的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，提高孕激素受體(PGR)、Ⅰ型雌激素受體(ESRⅠ)、補(bǔ)體C3等子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)因子的表達(dá)，從而改善內(nèi)膜容受性[10]。在子宮內(nèi)膜從增生期轉(zhuǎn)化為分泌期的過程中，HCG促進(jìn)子宮內(nèi)膜分泌多種細(xì)胞因子。在種植窗期，HCG同樣誘導(dǎo)分泌多種細(xì)胞因子[4]。另有研究報(bào)道，長(zhǎng)期暴露在低劑量HCG下的子宮內(nèi)膜，其細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1和2的磷酸化受阻，可降低細(xì)胞外間質(zhì)的粘合性，改變緊密連接的完整性，提示HCG的過早暴露可能降低內(nèi)膜的容受性。囊胚移植前行HCG宮腔灌注，內(nèi)膜暴露于HCG的時(shí)間短于凍融第3天胚胎移植前的灌注，此時(shí)內(nèi)膜的容受性更佳，更能提高囊胚的種植率。

既往胚胎移植前HCG宮腔灌注對(duì)IVF-ET妊娠結(jié)局的影響報(bào)道不一[11-12]，且之前研究主要報(bào)道凍融第3天胚胎移植前HCG宮腔灌注的臨床效果[13]，目前尚未見有關(guān)凍融囊胚移植前HCG宮腔灌注對(duì)臨床結(jié)局影響的報(bào)道。馬榮花等[14]研究發(fā)現(xiàn)HCG宮腔灌注可明顯提高宮腔灌注組胚胎種植率及臨床妊娠率，宮腔灌注組和未行宮腔灌注組兩組早期流產(chǎn)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果提示反復(fù)種植失敗患者接受HCG宮腔灌注后與未灌注組比有更高的種植率、臨床妊娠率及活產(chǎn)率，但流產(chǎn)率組間比較無明顯差異，與馬榮花等[14]結(jié)果一致。另外，本研究中，灌注組患者的生化妊娠率亦明顯增加，但生化妊娠對(duì)患者無明顯副作用。

本研究也存在一些局限性，本研究中HCG的灌注量為500 U，灌注時(shí)間為移植前24 h。有研究認(rèn)為灌注時(shí)間為移植前15 min、灌注量為500 U時(shí)，患者的種植率、臨床妊娠率及活產(chǎn)率最高[15]，但目前關(guān)于HCG灌注的時(shí)間、灌注劑量尚存在爭(zhēng)議，無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。且本研究為回顧性病例研究，存在一些不可避免的干擾因素，如樣本的選擇偏差、臨床醫(yī)師的經(jīng)驗(yàn)差異等。因此，有必要對(duì)反復(fù)種植失敗患者囊胚移植前的HCG灌注時(shí)間、HCG灌注劑量做進(jìn)一步大樣本的前瞻性隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)進(jìn)行分析和研究。

綜上所述，凍融囊胚移植前HCG宮腔灌注可以明顯改善反復(fù)種植失敗患者的臨床結(jié)局。同時(shí)，凍融囊胚移植前HCG灌注的時(shí)間、灌注劑量尚存在爭(zhēng)議，后續(xù)尚需大樣本的隨機(jī)對(duì)照研究深入探討。