張慧敏，朱文倩，馬靜，徐仰英，張玉，沈偉，郝翠芳,5*

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部，青島 266071；2.濱州醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，煙臺(tái) 264010；3.青島大學(xué)附屬青島市婦女兒童醫(yī)院生殖中心，青島 266011；4.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青島 266109;5.青島大學(xué)附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院生殖中心，煙臺(tái) 264000)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種常見的內(nèi)分泌疾病[1]，約占育齡婦女的5%～10%[2]，約占無排卵性不孕癥的75%[3]。PCOS是一種異質(zhì)性綜合征，臨床表型多樣，包括高雄激素血癥、月經(jīng)不調(diào)和多囊卵巢形態(tài)[4]。除不孕外，PCOS的表現(xiàn)通常包括肥胖、多毛、胰島素抵抗、高風(fēng)險(xiǎn)的子宮內(nèi)膜癌、代謝綜合征[5]、2型糖尿病和心血管疾病[6-7]。MicroRNAs(miRNAs)是一種短的非編碼內(nèi)源性RNA(19～25 bp)，能夠通過與靶信使RNA(mRNA)上3′UTR處的互補(bǔ)核苷酸結(jié)合來降低mRNA的穩(wěn)定性或抑制翻譯[8-9]。有報(bào)道指出miR-1270能影響卵巢癌細(xì)胞的增殖凋亡，且高表達(dá)的miR-1270還能降低卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[10-11]。

CYP19A1(Cytochrome P450 19A1 gene)基因編碼的細(xì)胞色素P450芳香化酶(P450arom)是雌激素合成的限速酶[12]。雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素(雄激素和睪酮分別轉(zhuǎn)化為雌酮和雌二醇)時(shí)，由于CYP19的異常表達(dá)或P450arom的活性抑制而受到限制[13-14]。本研究通過檢測(cè)miR-1270及其靶基因CYP19A1在PCOS患者卵丘顆粒細(xì)胞中的表達(dá)，探討分析其對(duì)雌激素生成的影響，為PCOS排卵障礙的分子機(jī)制研究提供新的理論依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象及樣本收集

選擇2019年4月至2020年12月期間在煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院和青島市婦女兒童醫(yī)院生殖中心就診的不孕患者，其中45例月經(jīng)不調(diào)的PCOS患者(煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院14例，青島市婦女兒童醫(yī)院31例)為PCOS組，65例無PCOS的不孕患者作為對(duì)照組，記錄兩組患者的基本臨床資料和促排卵情況；并收集兩組患者的卵丘顆粒細(xì)胞開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)室研究。本研究經(jīng)青島大學(xué)附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院和青島市婦女兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過。

根據(jù)Rotterdam標(biāo)準(zhǔn)(2004)，患者納入PCOS組至少符合以下兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：卵巢多囊樣改變；無排卵或稀發(fā)排卵；臨床或生化高雄激素血癥癥狀。排除標(biāo)準(zhǔn)：先天性腎上腺增生、庫欣綜合征與雄激素分泌性腫瘤等高雄激素血癥疾?。患谞钕俟δ芸哼M(jìn)，高泌乳素血癥等內(nèi)分泌性疾?。环驄D雙方染色體異常。所有患者年齡小于35歲，均進(jìn)行體外受精(IVF)或卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)助孕治療。

二、材料

1.主要試劑和儀器：miRNA分離試劑盒(北京天根)；miRcute Plus miRNA第一鏈cDNA試劑盒(北京天根)；SPARKscriptⅡRT-Plus逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(山東思科捷)；SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit(湖南艾科瑞)；QuantStudioTM5實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(Applied Biosystems，美國(guó))；兔抗CYP19A1多抗(ab18995，Abcam，美國(guó))；兔抗β-Actin多抗(D110007，上海生工)；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(A0208，上海碧云天)；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(KGE014，R&D，美國(guó))；雙熒光素酶報(bào)告試劑盒(南京諾唯贊)；qRT-PCR引物及雙熒光素酶報(bào)告載體由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成；miRNA的過表達(dá)模擬物和抑制劑(mimic及inhibitor)及mimic的陰性對(duì)照(mimic NC)由蘇州吉瑪有限公司設(shè)計(jì)合成。

2.細(xì)胞株：人卵巢顆粒細(xì)胞(KGN)購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，人胚腎細(xì)胞(293T)由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院沈偉教授贈(zèng)予。

3.生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫：NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，RNA22(https：//cm.jefferson. edu/rna22/Precomputed/)，RNAhybrid(https：//bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid)用于預(yù)測(cè)靶mRNA及其結(jié)合位點(diǎn)。KEGG信號(hào)通路數(shù)據(jù)庫(https：//www.genome.jp/kegg/pathway.html)用于篩選信號(hào)通路。

三、研究方法

1.生物信息學(xué)：生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-1270的靶基因，根據(jù)靶基因mRNA3′UTR與 miRNAs序列堿基互補(bǔ)的原則篩選兩者最可能的結(jié)合位點(diǎn)。

2.臨床資料收集：分別對(duì)PCOS組(n=45)及正常對(duì)照組(n=65)患者的臨床特征資料進(jìn)行回顧分析。收集的內(nèi)容包括：年齡、不孕年限、體重指數(shù)(BMI)、抗苗勒管激素(AMH)、黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、LH/FSH，雌二醇(E2)、睪酮(T)、孕酮(P)、催乳素(PRL)、空腹血糖(FBG)水平以及竇卵泡數(shù)、獲卵數(shù)、胚胎形成率。

3.卵丘顆粒細(xì)胞的收集和細(xì)胞株培養(yǎng)：注射HCG扳機(jī)后36 h，超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺抽吸直徑≥16 mm的卵泡，獲得卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體。用針分離單個(gè)卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞。在PBS液中清洗3次后，將卵丘顆粒細(xì)胞保存在-80℃下直到RNA提取。KGN細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，293T細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，細(xì)胞培養(yǎng)保持在37℃、5%CO2的環(huán)境。

4.RNA提取和qRT-PCR：按照miRNA分離試劑盒說明書提取顆粒細(xì)胞總RNA和miRNAs，QuickDrop測(cè)定其濃度和純度，分別按照SPARKscriptⅡRT-Plus逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和miRcute-Plus-miRNA第一鏈cDNA試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄mRNA和miRNA為cDNA。按照SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit說明書操作，應(yīng)用QuantStudioTM5 qRT-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，分別以GAPDH和U6作為mRNA和miRNA的內(nèi)參。引物序列如下：GAPDH上游：5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′，下游：5′-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3′；CYP19A1上游：5′-GACTTTGCCACTGAGTTGATTT-3′，下游：5′-CGATCAGCATTTCCAATATGCA-3′；U6上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-1270：5′-GGAGATATGGAAGAGCTGTGT-3′；UnivR-miR：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。mRNA和miRNA均采用以下擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，然后按95℃ 5 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每組重復(fù)3次，采用2-△△CT法分析各基因的相對(duì)表達(dá)量。

5.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：在NCBI中查找CYP19A1基因3′UTR序列，根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與miR-1270的結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)包含結(jié)合位點(diǎn)的序列及突變型序列，長(zhǎng)360 bp，由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成并連接于pmirGLO載體上。用感受態(tài)大腸桿菌DH5a轉(zhuǎn)化，挑取陽性單菌落進(jìn)行搖菌并提取質(zhì)粒。含有結(jié)合位點(diǎn)的質(zhì)粒為野生型(CYP19A1-WT-3′UTR)，將結(jié)合位點(diǎn)全部突變的質(zhì)粒為突變型(CYP19A1-MUT-3′UTR)。轉(zhuǎn)染前1 d接種適量的293T細(xì)胞于48孔板，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。共分為4組，野生型實(shí)驗(yàn)組：CYP19A1-WT-3′UTR質(zhì)粒+miR-1270 mimic；野生型對(duì)照組：CYP19A1-WT-3′UTR質(zhì)粒+mimic NC；突變型實(shí)驗(yàn)組：CYP19A1-MUT-3′UTR質(zhì)粒+miR-1270 mimic；突變型對(duì)照組：CYP19A1-MUT-3′UTR質(zhì)粒+mimic NC。按照lipofectamine2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并于轉(zhuǎn)染后6～8 h更換新的培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染24 h后，按照雙熒光素酶報(bào)告試劑盒說明書使用酶標(biāo)儀(BioTek，美國(guó))檢測(cè)熒光素酶活性，結(jié)果以相對(duì)熒光素酶活性(螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶)表示。

6.蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)：miR-1270 mimic或inhibitor轉(zhuǎn)染48 h后，收集KGN細(xì)胞，用RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑(PMSF)在冰上裂解。每個(gè)蛋白質(zhì)樣品用8%SDS-PAGE凝膠分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下用5%牛血清白蛋白(BSA)封閉1.5 h，并與CYP19A1或β-actin(1∶1 000稀釋)一抗在4℃下培養(yǎng)過夜。然后用PBST清洗這些膜，并在室溫下與HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000稀釋)孵育1.5 h。PBST清洗后，使用超敏化學(xué)發(fā)光液在VIBER Newton 7.0成像系統(tǒng)檢測(cè)條帶灰度。以β-actin灰度值作為內(nèi)源性對(duì)照得到CYP19A1的相對(duì)表達(dá)量。

7.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)：miR-1270 mimic或inhibitor轉(zhuǎn)染48 h后，收集KGN細(xì)胞的上清液，以1 000 r/min在4℃離心10 min后，將上清液收集后，按照酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒說明書，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)E2水平。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、不孕患者的一般資料和臨床特征

PCOS組不孕患者的竇卵泡數(shù)、BMI、AMH、LH、LH/FSH、PRL、T均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，F(xiàn)SH略低于對(duì)照組但尚無顯著性差異(P>0.05)；促排卵之后，PCOS組的獲卵數(shù)也顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；但胚胎形成率組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組間年齡、不孕年限、P、E2、FBG差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 PCOS和對(duì)照組不孕患者的一般資料和臨床特征比較(-±s)

二、生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-1270靶基因

通過RNA22和RNAhybrid在線數(shù)據(jù)庫工具篩選出miR-1270的靶基因，取其交集共計(jì)9 282個(gè)基因(圖1)。在KEGG上富集信號(hào)通路，最終選擇卵巢類固醇生成途徑中的限速酶CYP19A1作為研究對(duì)象(圖2)。

三、miR-1270和CYP19A1在卵丘顆粒細(xì)胞中的表達(dá)水平

qRT-PCR檢測(cè)miR-1270和CYP19A1在PCOS患者卵丘顆粒細(xì)胞中的表達(dá)變化。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-1270在PCOS患者卵丘顆粒細(xì)胞中的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)(圖3A)，而CYP19A1的表達(dá)量顯著上升(P<0.05)(圖3B)。

圖1 生物信息學(xué)工具(RNA22和RNAhybrid)預(yù)測(cè)miR-1270的候選靶基因

圖2 KEGG信號(hào)通路分析：CYP19A1參與的卵巢類固醇生成通路示意圖(來源：https://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway？157899344364697/hsa04913.args)

與對(duì)照組比較，*P<0.05圖3 miR-1270和CYP19A1在PCOS和對(duì)照組患者卵丘顆粒細(xì)胞中的表達(dá)水平比較

四、miR-1270通過靶向CYP19A1抑制KGN細(xì)胞E2合成

雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-1270 mimic可顯著抑制CYP19A1野生型3′UTR報(bào)告載體的熒光素酶活性，而對(duì)突變型無明顯抑制作用(圖4A)。Western Blot分析發(fā)現(xiàn)CYP19A1的表達(dá)在miR-1270的過表達(dá)后顯著下調(diào)(P<0.05)(圖4B)。而抑制miR-1270可以在mRNA和蛋白質(zhì)水平增強(qiáng)KGN細(xì)胞中CYP19A1的表達(dá)(P<0.05)(圖4C)。用miR-1270 mimic轉(zhuǎn)染KGN細(xì)胞可顯著減少E2的產(chǎn)生(P<0.05)；相反，miR-1270的抑制劑增強(qiáng)了KGN細(xì)胞培養(yǎng)基中E2的產(chǎn)生(P<0.05)(圖4D)。

A：模式圖顯示了熒光素酶報(bào)告基因中miR-1270與CYP19A1的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)，野生型或突變型結(jié)合位點(diǎn)以紅色字體表示。柱狀圖顯示野生型實(shí)驗(yàn)組CYP19A1-WT-3′UTR質(zhì)粒+miR-1270 mimic、野生型對(duì)照組CYP19A1-WT-3′UTR質(zhì)粒+mimic NC、突變型實(shí)驗(yàn)組CYP19A1-MUT-3′UTR質(zhì)粒+miR-1270 mimic和突變型對(duì)照組CYP19A1-MUT-3′UTR質(zhì)粒+mimic NC熒光素酶相對(duì)表達(dá)量(CYP19A1-WT-3′UTR質(zhì)粒+miR-1270 mimic與CYP19A1-WT-3′UTR質(zhì)粒+mimic NC比較，*P<0.05)。B～D：分別用Western blot實(shí)驗(yàn)、qRT-PCR實(shí)驗(yàn)、ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-1270 mimic或inhibitor后CYP19A1的蛋白水平、mRNA水平和終產(chǎn)物E2的水平。與同組中對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖4 miR-1270通過靶向結(jié)合CYP19A1抑制KGN細(xì)胞E2合成

討 論

PCOS是育齡期女性常見的內(nèi)分泌性疾病，主要的臨床表現(xiàn)為高雄激素血癥、月經(jīng)異常、肥胖和不孕。而引起不孕的主要原因是卵泡發(fā)育障礙，其卵泡發(fā)育停滯在竇狀卵泡階段[15-16]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，非編碼RNA在多種疾病中均有參與。其中的miRNA是一種保守的、內(nèi)源性的、非編碼的、小的單鏈RNA分子，在細(xì)胞各個(gè)功能中起著重要的調(diào)控作用[17]，如凋亡、增殖和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。miRNAs可以選擇性地分泌到血液、血漿或血清甚至卵泡液中，并被認(rèn)為是治療的靶點(diǎn)或不同疾病診斷的生物標(biāo)志物[18]。比如miR-143-3p通過靶向KLF5并失活Wnt/β-catenin途徑抑制人牙周膜細(xì)胞的成骨分化[19]；miR-146a-5p可以抑制壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)中的NLRP3下游炎性因子和CLIC4的表達(dá)進(jìn)而減輕NEC引起的腸道炎癥和腸道損傷[20]。

近年來許多研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在PCOS患者的卵泡液[21-22]、卵丘顆粒細(xì)胞[23]甚至血液[24-25]里異常表達(dá)，并且通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、激素的生物合成和分泌參與PCOS的發(fā)病過程。近期研究表明，miRNA能夠通過靶向結(jié)合多種下游mRNA，調(diào)控激素合成[26-27]，進(jìn)而影響卵泡發(fā)育。比如lncRNA ZFAS1/miR-129/HMGB1軸和lncRNA PVT1/miRNA-17-5p/PTEN軸都能抑制PCOS顆粒細(xì)胞凋亡并促進(jìn)E2和孕激素(P4)的分泌，進(jìn)而影響PCOS的卵泡發(fā)育[28-29]；miR-155可以作為血液標(biāo)志物監(jiān)測(cè)PCOS高雄激素血癥和抗雄激素的治療效果[30]。

本研究通過qRT-PCR及后續(xù)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，首次揭示了PCOS患者卵丘顆粒細(xì)胞中miR-1270及其靶基因CYP19A1的表達(dá)及作用。首先通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，找到與卵巢類固醇生成通路有關(guān)的miR-1270靶基因，預(yù)測(cè)信息和實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)CYP19A1是miR-1270的靶基因。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照組相比，PCOS組患者卵丘顆粒細(xì)胞中miR-1270表達(dá)量顯著降低，而CYP19A1的表達(dá)量顯著增高。進(jìn)一步用qRT-PCR和Western blot在KGN細(xì)胞系進(jìn)行功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)CYP19A1的表達(dá)受miR-1270的影響，miR-1270過表達(dá)時(shí)CYP19A1的表達(dá)受到抑制，而敲低miR-1270時(shí)則相反。進(jìn)一步采用ELISA對(duì)miR-1270是否影響CYP19A1的終產(chǎn)物E2進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-1270能夠使KGN分泌E2的能力降低，進(jìn)一步證實(shí)miR-1270能夠靶向結(jié)合CYP19A1抑制E2合成。

有研究證明，類固醇激素生成酶，如CYP11A1、CYP19A1和3β-HSD，在PCOS小鼠的顆粒細(xì)胞中增加，同時(shí)伴隨E2和P的增加[31]。P450scc、3β-HSD、P450arom(CYP19A1)在PCOS婦女多囊卵巢和其他動(dòng)物模型中的表達(dá)也較高[32-33]。CYP19可能作為PCOS表型的遺傳修飾物[34]。已有研究表明雌激素是卵巢甾體生成途徑的最終產(chǎn)物，因此芳香化酶可以作為選擇性抑制的靶點(diǎn)。芳香化酶抑制劑，如來曲唑，在臨床上廣泛應(yīng)用于PCOS排卵誘導(dǎo)[12]。來曲唑治療后E2水平和芳香化酶活性顯著降低[35]，此外，沒有證據(jù)表明終產(chǎn)物E2對(duì)CYP19A1有抑制作用[36]。來曲唑治療PCOS的作用機(jī)制可能是通過抑制芳香化酶抑制雌激素的分泌，進(jìn)一步減弱雌激素對(duì)下丘腦/垂體軸的負(fù)反饋?zhàn)饔?，促性腺激素分泌增加刺激FSH生物合成[12，37-38]。FSH促進(jìn)芳香化酶表達(dá)，然后顯著加速卵泡發(fā)育[39-40]，但具體的分子機(jī)制尚不明確。PCOS不孕患者伴隨miR-1270降低，減少靶向調(diào)控CYP19A1的作用，促進(jìn)芳香化酶的產(chǎn)生，進(jìn)而增加雌激素的合成，影響PCOS卵泡的發(fā)育(圖5)。本研究為芳香化酶抑制劑的臨床應(yīng)用提供了新的分子理論依據(jù)。

圖5 PCOS患者和正常人的顆粒細(xì)胞中miR-1270對(duì)卵泡發(fā)育的影響示意圖

綜上所述，miR-1270和CYP19A1在PCOS患者卵泡發(fā)育障礙方面發(fā)揮重要作用，本研究有助于進(jìn)一步了解PCOS的病理生理機(jī)制，特別是雌激素分泌的調(diào)節(jié)對(duì)卵泡發(fā)育的影響，以期為PCOS靶向診治提供新思路。