基于trnH-psbA和matK序列的不同種油茶種苗DNA條形碼分析

代佳妮　于靖　戚華沙　鄭蔚　王健　吳友根　賴杭桂　胡新文

摘 ?要：為有效鑒別出不同種油茶種苗，收集101份不同種油茶種苗作為試材，其中18份越南油茶、79份普通油茶、1份博白大果油茶、3份紅花油茶，利用葉綠體基因組trnH-psbA和matK序列進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序分析，隨后對(duì)序列進(jìn)行拼接及特征分析，并計(jì)算樣本種間及種內(nèi)遺傳距離，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明：101份供試材料的trnH-psbA序列全長381 bp，有10個(gè)變異位點(diǎn)，可通過變異位點(diǎn)鑒別出越南油茶、紅花油茶及部分普通油茶，系統(tǒng)發(fā)育樹將越南油茶聚為一支，自展支持率為64%;matK序列全長797 bp，有5個(gè)變異位點(diǎn)，可通過變異位點(diǎn)鑒別出越南油茶、紅花油茶及部分普通油茶，系統(tǒng)發(fā)育樹將紅花油茶聚為一支，越南油茶聚為一支，自展支持率分別為65%和64%。因此，trnH-psbA序列可對(duì)越南油茶進(jìn)行有效鑒別，而matK序列可對(duì)越南油茶和紅花油茶進(jìn)行有效鑒別。該研究結(jié)果對(duì)避免油茶種苗混雜、規(guī)范海南油茶種苗市場有一定的指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：trnH-psbA序列;matK序列;油茶;DNA條形碼

中圖分類號(hào)：S794.4 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DNA Barcoding Identification of Different Species in Camellia Based on trnH-psbA and matK Sequences

DAI Jiani1， YU Jing1*， QI Huasha1， ZHENG Wei1， WANG Jian1， WU Yougen1， LAI Hanggui2， HU Xinwen2

1. Institute of Horticulture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. College of Tropical Crops， Hainan University， Hai-kou， Hainan 570228， China

Abstract： In order to effectively identify the species of Camellia seedlings， we collected 101 samples of Camellia seedlings as the test materials， including 18 C. vietnamensis， 79 C. oleifera， 1 C. gigantocarpa， and 3 C. chekiangoleosa. In order to identify all the samples effectively， the trnH-psbA and matK sequences of the chloroplast genome were used for amplification and sequencing analysis， followed by splicing and characterization of the sequences. Subsequently， the sequences were spliced and analyzed， and the genetic distances between the samples were calculated， and the phylogenetic tree was constructed. The results showed that the trnH-psbA sequence of the 101 test materials was 381 bp in length and had 10 mutation sites， which could be used to identify C. vietnamensis， C. chekiangoleosa and parts of C. oleifera. Phylogenetic trees gathered C. vietnamensis as a branch with a self-developed support rate of 64%. The matK sequence showed 797 bp in length and had 5 mutation sites. C. vietnamensis， C.chekiangoleosa and parts of C. oleifera could be identified by the mutation sites. The phylogenetic tree showed that all C. chekiangoleosa species were clustered into one branch with a self-developed support rate of 65%， and all C. vietnamensis species were clustered into one branch with a self-developed support rate of 64%. Therefore， the trnH-psbA sequence could be used to identify C. vietnamensis effectively， and the matK sequence could be used to identify C. vietnamensis and C. chekiangoleosa effectively. The results have certain practical significance for avoiding the hybridization of Camellia seedlings as well as regulating the Hainan Camellia seedling market.

Keywords： trnH-psbA sequence; matK sequence; Camellia; DNA barcode

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.03.001

油茶是山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）中種子油脂含量較高且具有一定經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物總稱，所屬物種約有50個(gè)，多為常綠小喬木[1]。油茶籽油中不飽和脂肪酸的含量高于90%，此外，還富含植物甾醇、維生素E、多酚、角鯊烯和類胡蘿卜素等多種功能性成分，在預(yù)防和治療心腦血管疾病、抗菌消炎、抗老化等方面，均可發(fā)揮一定的作用[2]。油茶在中國已有約2000年的栽培歷史，是我國四大木本油料作物之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)價(jià)值[3]，其在長江流域和亞熱帶的高山及丘陵地帶多有種植[4]，分布于湖南、江西、福建等18個(gè)省市[5]。我國油茶種質(zhì)資源非常豐富，主栽培種包括普通油茶（Camellia oleifera Abel.）、越南油茶（Camellia vietnamensis T. C. Huang ex Hu）、博白大果油茶（Camellia gigantocarpa）、紅花油茶（Camellia chekiangoleosa）等[6]。海南省曾是廣東的一個(gè)行政區(qū)，加之部分海南島油茶果形接近高州油茶，因此，有些學(xué)者和海南民間多數(shù)認(rèn)為海南島油茶屬高州油茶（越南油茶C. vietnamensis）[7]。越南油茶適應(yīng)海南島常年高溫高濕的生態(tài)環(huán)境，但產(chǎn)果量低于普通油茶。近年來，為了提高茶果產(chǎn)量，許多種植戶試圖引進(jìn)內(nèi)陸普通油茶在海南島上種植，但外來苗木在海南島的表現(xiàn)普遍較差，生長速度緩慢、抗逆性差、易受病蟲侵害，從而導(dǎo)致存活率較低，盲目的大面積引種普通油茶曾一度造成了海南油茶產(chǎn)業(yè)的重大損失[8]。目前，海南省市場上的油茶種苗魚龍混雜，不少商販利用普通油茶種子繁育實(shí)生苗或作為砧木以降低育苗成本，種植戶不慎購買后會(huì)面臨油茶死亡率高、結(jié)果率低的風(fēng)險(xiǎn)。因此，采取有效手段對(duì)油茶種苗進(jìn)行鑒別，對(duì)海南油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有著重要的實(shí)際意義[9]。

在油茶種質(zhì)資源鑒定方面，目前常用的有形態(tài)學(xué)鑒定和分子標(biāo)記技術(shù)2種方法。在形態(tài)學(xué)鑒定方面，主要以數(shù)量性狀作為依據(jù)進(jìn)行分類，如劉姝利等[10]選取了50株湖北麻城的早熟油茶，通過觀測(cè)其種實(shí)顏色、形狀及成熟期等性狀，對(duì)該地油茶種質(zhì)資源進(jìn)行了評(píng)估;楊立榮等[11]以海南省21個(gè)老油茶林為研究對(duì)象， 取其種實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)果實(shí)質(zhì)量、出籽率、果皮厚度等10個(gè)數(shù)量性狀指標(biāo)進(jìn)行了觀測(cè)，從而探究了海南油茶與高州油茶的異同之處，為提高種質(zhì)資源選育效率提供了基礎(chǔ)。在分子學(xué)方面，姜德志等[12]選取了109個(gè)油茶種質(zhì)材料為樣本，采用ISSR分子標(biāo)記和聚類分析，鑒定了材料間的親緣關(guān)系;謝薈等[13]利用SRAP分子標(biāo)記，圍繞廣西省廣寧紅花油茶種質(zhì)資源遺傳多樣性展開了研究?；诜肿訑?shù)據(jù)及相應(yīng)分析手段應(yīng)用于分類鑒定是對(duì)傳統(tǒng)鑒定方法的有益補(bǔ)充，尤其是DNA條形碼技術(shù)的出現(xiàn)，為物種鑒定提供了新的思路。DNA條形碼是通過一段較短的標(biāo)準(zhǔn)基因片段作為分子探針，對(duì)物種進(jìn)行鑒定的分子生物學(xué)技術(shù)。目前，葉綠體片段matK、rbcL、trnH-psbA和核糖體基因及其轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的ITS/ITS2等標(biāo)準(zhǔn)條形碼常以不同的組合的形式用于植物鑒定中[14]。與其他鑒定方法相比，使用基于測(cè)序的DNA條形碼可以有效提高物種鑒定穩(wěn)定性、縮短鑒定時(shí)間、降低物種鑒定技術(shù)門檻，因此，為了更好地對(duì)海南油茶種苗進(jìn)行鑒定，本研究收集了海南大學(xué)儋州校區(qū)油茶種質(zhì)資源圃的101份油茶材料，基于DNA條形碼技術(shù)，利用trnH-psbA序列和matK序列對(duì)不同油茶樣本進(jìn)行鑒定，旨在評(píng)價(jià)這2個(gè)序列在鑒別不同油茶物種上的可行性及有效性，為不同種油茶種苗的鑒別提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?試驗(yàn)材料 ?于2018年采自海南大學(xué)儋州校區(qū)的油茶種質(zhì)資源圃，共101份樣本，包括越南油茶18份，紅花油茶3份，博白大果油茶1份，普通油茶樣本79個(gè)，試材編號(hào)及樣品信息見表1。采集油茶新梢幼葉，迅速用硅膠干燥，常溫保存。

1.1.2 ?試劑和儀器 ?植物基因組DNA提取試劑盒（中國福際FORE GENE公司）、引物（上海生工）、瓊脂糖、PCR MIX（含染料）、GoldView核酸染液、1×TAE緩沖液、2kb DNA marker、無水乙醇、β-巰基乙醇、6×Loading Buffer。電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特）、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（西川蜀科）、萬分之一分析天平（上海佑科）、PCR擴(kuò)增儀（杭州安杰思）、立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安）、迷你電泳儀（杭州奧盛）、全自動(dòng)雪花制冰機(jī)（常熟雪科）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?葉片總DNA提取 ?經(jīng)硅膠干燥的葉片，用植物基因組DNA提取試劑盒提取各樣本總DNA。用萬分之一分析天平稱取瓊脂糖1.00 g，加入1× TAE緩沖液50 mL，配制2.00%瓊脂糖，混勻后微波爐加熱2 min，滴加GoldView核酸染液2 μL，混勻倒入電泳槽中，待凝固后將電泳槽放入電泳儀中。取每個(gè)樣本總DNA 5 μL 和6× Loading Buffer 1 μL混勻后點(diǎn)樣進(jìn)行電泳檢測(cè)，剩余總DNA保存4 ℃冰箱備用。

1.2.2 ?PCR擴(kuò)增 ?參照Kuzmina等[15]和Sang等[16]的方法設(shè)計(jì)適用于油茶trnH-psbA和matK序列的特異性引物，分別用于PCR擴(kuò)增和測(cè)序。trnH-psbA正向引物序列：GTTATGCATGAAC GTAATGCTC，反向引物序列：CGCGCATGGTG GATTCACAATCC;matK正向引物序列：CGTAC AGTACTTTTGTGTTTAC GAG，反向引物序列：ACCCAGTCCATCTGGA AATCTTGGTTC。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：PCR Mix 12.5 μL，引物F（10 μmol/L）1.0 μL，引物R（10 μmol/L）1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

1.2.3 ?雙向測(cè)序 ?委托上海桑尼生物科技有限公司完成。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

獲得測(cè)序峰圖后，利用CodonCode Aligner V 8.0.1軟件進(jìn)行序列校對(duì)拼接，在此基礎(chǔ)上輔以人工校正。為了驗(yàn)證所得序列是否為目標(biāo)序列，使用NCBI在線工具對(duì)完整的trnH-psbA和matK序列進(jìn)行BLAST相似性檢索（越南油茶trnH-psbA序列的GenBank登錄號(hào)為KX121735.1，matK序列的GenBank登錄號(hào)為KX216418.1;紅花油茶trnH-psbA序列的GenBank登錄號(hào)為HQ427072.1，matK序列的GenBank登錄號(hào)為MG431968.1;博白大果油茶trnH-psbA序列和matK序列的GenBank登錄號(hào)均為AB443612.1;普通油茶trnH-psbA序列和matK序列的GenBank登錄號(hào)均為KY406750.1。）。序列間變異位點(diǎn)的分析、種內(nèi)和種間遺傳距離的計(jì)算[基于Kimura-2- Parameter （K2P）模型]以及鄰接（NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建均利用MEGA 5.0軟件進(jìn)行分析完成。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?總DNA提取和PCR擴(kuò)增

本試驗(yàn)101份樣本提取總DNA電泳質(zhì)量檢測(cè)均出現(xiàn)明亮清晰且單一的條帶，說明干燥油茶新梢幼葉樣本總DNA提取成功率為100%（圖1）。由圖2和圖3可知，PCR產(chǎn)物電泳條帶清晰，表明該序列擴(kuò)增條帶純度較高;有些條帶也出現(xiàn)亮度偏暗情況，表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物濃度偏低。

2.2 ?trnH-psbA和matK序列的特征分析

如表2所示，trnH-psbA序列長381 bp，G+C含量24.90%，符合葉綠體基因GC含量較低的特點(diǎn)，有10個(gè)變異位點(diǎn)，占全長的2.68%，有7個(gè)簡約信息位點(diǎn)，占總長度的1.84%，轉(zhuǎn)換與顛換的比值為0.52，能夠提供較多的物種鑒定信息。matK序列全長797 bp，G+C含量為32.50%;簡約信息位點(diǎn)共3個(gè)，序列較保守;變異位點(diǎn)5個(gè)，分別為202、583、700、708、782 bp位點(diǎn);序列的轉(zhuǎn)換與顛換的比值為1.06，主要是G與A之間發(fā)生轉(zhuǎn)換。

由表3可知，trnH-psbA序列根據(jù)10個(gè)變異位點(diǎn)把101份油茶樣本歸類成12大類，變異位點(diǎn)分別為117、173～179、253、280、281、331、362、

363、368、375 bp。其中，類型五（博白大果油茶）在368 bp和375 bp分別由G和T變?yōu)門和G，117 bp缺失，由此根據(jù)3個(gè)變異位點(diǎn)來鑒別博白大果油茶，但本實(shí)驗(yàn)只有1個(gè)博白大果油茶樣本，需進(jìn)一步驗(yàn)證。3份紅花油茶樣本被歸為兩類（類型三和類型六），均在331 bp由T變異為C，在368 bp由G變異為T，因此可初步根據(jù)331 bp和368 bp兩個(gè)變異位點(diǎn)來鑒別紅花油茶。18份越南油茶樣本中有17份trnH-psbA序列完全一致，類型一（番賽一）在375 bp存在1處種內(nèi)變異，這可能與環(huán)境、地理因素的影響相關(guān)，其余越南油茶樣本均歸類為類型二，在331、363、368 bp處發(fā)生變異，初步認(rèn)為這3個(gè)變異位點(diǎn)可用來鑒別越南油茶。通過比較79份普通油茶（表1中序號(hào)為23～101）的trnH-psbA序列，發(fā)現(xiàn)均出現(xiàn)變異位點(diǎn)，歸類為類型四、類型七至類型十二，所有普通油茶樣本在363 bp處均未發(fā)生變異，大部分普通油茶在331 bp處未變異，少量普通油茶在331 bp處變異為C，因此可根據(jù)331 bp和363 bp這2個(gè)變異位點(diǎn)來鑒別部分普通油茶。

由表4可知，matK序列根據(jù)5個(gè)堿基位點(diǎn)把101份油茶樣本歸類成6大類，變異位點(diǎn)分別為202、583、700、708、782 bp。其中，類型一包括18份越南油茶，在583 bp位點(diǎn)由G變?yōu)锳，該變異位點(diǎn)可用來鑒別越南油茶，類型二包括3份紅花油茶樣品，均在202 bp處由A變異為C，其余位點(diǎn)無變異，因此202 bp可用于紅花油茶的鑒別。類型三、類型四、類型五對(duì)應(yīng)的堿基突變位點(diǎn)分別為708、782、700 bp，其樣品均為普通油茶，因此，這3個(gè)位點(diǎn)可用于普通油茶單株的鑒別。類型六（67份普通油茶和1份博白大果油茶）的matK序列均未發(fā)生變異，即博白大果油茶未產(chǎn)生特異性的變異位點(diǎn)，matK序列未能將博白大果區(qū)分鑒別出來。

2.3 ?trnH-psbA序列種內(nèi)、種間遺傳距離分析

種間遺傳距離大于種內(nèi)遺傳距離可作為理想DNA條形碼序列要求，trnH-psbA序列種內(nèi)和種間遺傳距離見表5和表6，普通油茶與其他油茶的最小種間遺傳距離為0.005，最大種內(nèi)遺傳距離為0.011，不滿足理想DNA條形碼要求，表明trnH-psbA序列不能有效區(qū)分普通油茶與其他油茶。紅花油茶與其他油茶的最小種間遺傳距離為0.003，最大種內(nèi)遺傳距離為0.003，不滿足理想

DNA條形碼的要求，表明trnH-psbA序列不能有效鑒別出紅花油茶。博白大果油茶與其他油茶的最小種間遺傳距離為0.005，沒有種內(nèi)遺傳距離（只有1個(gè)樣本），無法通過遺傳距離得出結(jié)論，若加大樣本量可進(jìn)一步得到驗(yàn)證。越南油茶與其他油茶的最小種間遺傳距離為0.003，最大種內(nèi)遺傳距離為0.003，初步表明該序列不能有效鑒別越南油茶。

2.4 ?matK序列種內(nèi)、種間遺傳距離分析

由表7和表8可看出，越南油茶最大種內(nèi)遺傳距離為0，與其他油茶最小種間遺傳距離為0.001，其種間遺傳距離大于種內(nèi)遺傳距離，表明matK序列可將越南油茶與其他油茶進(jìn)行區(qū)分。普通油茶最大種內(nèi)遺傳距離為0.001，與其他油茶的最小種間遺傳距離為0，即matK序列無法對(duì)普通油茶進(jìn)行鑒別。紅花油茶的最大種內(nèi)距離為0，與其他油茶的最小種間距離為0.001，表明matK序列可用來鑒別紅花油茶。由于博白大果油茶只有1個(gè)樣本，無法通過遺傳距離得出結(jié)論，若加大樣本量可進(jìn)一步得到驗(yàn)證，除此之外，可通過博白大果所特有的外形長勢(shì)將與其他品種進(jìn)行區(qū)分鑒別。綜上所述，matK序列可鑒別紅花油茶和越南油茶。

2.5 ?系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

2.5.1 ?trnH-psbA序列系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 ?通過MEGA 5.05軟件用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，trnH-psbA序列如圖4所示，所有樣本聚為6大支。其中18個(gè)越南油茶樣品聚為一大支，自展支持率為64%;樣品H9、H19、仙207和仙93聚為一大支，自展支持率為89%;樣品15-2、D6、N3、N8、N9、N41聚為一大支，自展支持率為66%。長林53、仙41等11份普通油茶和1份博白大果油茶聚為一小支，自展支持率為63%，表明普通油茶與博白大果親緣關(guān)系較近，可能在物種進(jìn)化過程中發(fā)生了基因交流;3份紅花油茶中，有2份樣品（紅二、紅三）聚為一支，紅一則單獨(dú)成一支，自展支持率均低于50%，可能因?yàn)榧t花油茶的種源差異較大且多態(tài)性豐富。通過對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹的分析得出，利用trnH-psbA序列可有效區(qū)分越南油茶和其他油茶。

2.5.2 ?matK序列系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 ?matK序列系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建結(jié)果如圖5所示，其中18份越南油茶單獨(dú)聚為一支，3份紅花油茶單獨(dú)聚為一支，自展支持率分別為64%和65%;B6、GC8、Z12Z22H17等10份普通油茶樣本聚為一支，自展支持率為64%;博白大果與其余普通油茶未聚成支。以上結(jié)果表明matK序列可鑒別出紅花油茶和越南油茶，但不能對(duì)其他油茶進(jìn)行區(qū)分鑒別。

3 ?討論

油茶是我國特有的木本油料樹種[1]，其籽油中含有脂肪酸、植物甾醇、維生素E、多酚、角鯊烯和類胡蘿卜素等多種功能活性成分[2]，具有重要的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)價(jià)值[3]。研究表明，DNA條形碼技術(shù)可有效地對(duì)不同物種進(jìn)行分類鑒定，但在山茶科植物評(píng)價(jià)和鑒別上應(yīng)用較少[17]，目前，國際植物學(xué)界主推的植物條形碼序列主要有ITS2、matK、rbcL、trnH-psbA、rpoB等，其中matK序列的PCR擴(kuò)增成功率比較低，引物的通用性比較差[18]。trnH-psbA序列在物種鑒定方面有較高的鑒定成功率[19-20]，且葉綠體序列trnH-psbA在物種水平和屬水平鑒定效率遠(yuǎn)高于葉綠體其他條形碼候選序列[21]。

在山茶屬植物鑒別方面，戚華沙等[9]選取trnH-psbA、rbcL、matk和ITS2序列作為目的序列，對(duì)不同種油茶種子進(jìn)行鑒定，其中，利用trnH-psbA序列可將普通油茶與其他油茶種進(jìn)行有效鑒別，而matK序列則可用來鑒別越南油茶。在此基礎(chǔ)之上，本研究利用DNA條形碼技術(shù)，選取了trnH-psbA和matK序列對(duì)101份油茶樣品進(jìn)行鑒別。

結(jié)果表明，越南油茶可基于trnH-psbA序列和matK序列進(jìn)行鑒別;而紅花油茶和普通油茶則更適用基于matK序列的DNA條形碼進(jìn)行鑒定，其中，對(duì)普通油茶的鑒別還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證;可初步根據(jù)trnH-psbA序列的3個(gè)變異位點(diǎn)來鑒別博白大果油茶，但本研究博白大果油茶樣品不足，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。綜合以上結(jié)果，基于DNA條形碼技術(shù)，聯(lián)合使用trnH-psbA、和matK序列，可對(duì)越南油茶和紅花油茶進(jìn)行有效鑒別，該結(jié)果可為不同種油茶種苗的鑒別提供科學(xué)依據(jù)。除此之外，DNA條形碼技術(shù)的使用還可減少海南油茶種苗混雜的情況，對(duì)規(guī)范海南油茶種苗及茶油市場，推動(dòng)海南油茶產(chǎn)業(yè)更好發(fā)展有重要意義。日后可通過更多實(shí)驗(yàn)，探索出更多適合于山茶科植物，特別是油茶物種分類鑒別的理想DNA條形碼候選序列。

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責(zé)任編輯：黃東杰

收稿日期? 2020-03-01;修回日期? 2020-05-26

基金項(xiàng)目? 海南省自然科學(xué)基金高層次人才項(xiàng)目（No. 820RC585）;海南省重大科技計(jì)劃項(xiàng)目（No. ZDKJ2017004）。

作者簡介? 代佳妮（1996—），女，碩士研究生，研究方向：植物次生代謝。*通信作者（Corresponding author）：于? 靖（YU Jing），E-mail：yujinghxy@163.com。