麻瘋樹雜交子代與親本間基因組DNA甲基化分析

張辰笈　鄒枚伶　夏志強　孫倩　江思容　王文泉

摘 ?要：為揭示麻瘋樹（Jatropha curcas）雜交子代與親本間基因組甲基化變化規(guī)律，以1組親緣關(guān)系較遠且差異較大的親本雜交構(gòu)建的麻瘋樹遺傳群體為材料，采用AFSM技術(shù)挖掘麻瘋樹DNA甲基化位點，比較不同材料的甲基化水平，對其進行功能分析。結(jié)果表明：共檢測出537 234個甲基化位點，雜交子代DNA甲基化水平（0.29）顯著低于2個親本（0.39和0.35）。對不同全甲基化水平的樣品進行功能分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均富集于催化活性和蛋白結(jié)合，而相對于mCCGG全甲基化水平，CmCGG全甲基化水平樣品還富集于大分子復合物、細胞器等細胞組分，以及發(fā)育過程、生物過程、細胞過程、代謝過程等生物學過程。這對于進一步從表觀遺傳學角度揭示麻瘋樹維持必要的遺傳穩(wěn)定性形成的內(nèi)在機制具有重要意義。

關(guān)鍵詞：麻瘋樹;甲基化;遺傳群體

中圖分類號：Q943 ? ? ?文獻標識碼：A

Analysis of Genomic DNA Methylation Between Progenies and Parents for Jatropha curcas

ZHANG Chenji1，2， ZOU Meiling2， XIA Zhiqiang1，2，3， SUN Qian2，4， JIANG Sirong2，5， WANG Wenquan1，2，3，5*

1. Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Institute of Tropical Biosciences and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China; 3. Tropical Bio-omics and Big-Data Center， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China; 4. Guangxi University， Nanning， Guangxi 530004， China; 5. Nanjing Agricultural University， Nanjing， Jiangsu 210095， China

Abstract： In order to reveal the changes of genomic methylation between the progeny of Jatropha curcas and the parents， a group of J. curcas genetic groups constructed by crossing a group of distantly related parents with large differences was used as the test materials. The AFSM technology was used to mine the DNA methylation sites of J. curcas， to compare the methylation levels of different materials， and to perform functional analysis. In this study， a total of 537 234 methylated sites were identified. The DNA methylation level in the hybrid offsprings was significantly lower than that in J. curcas parents （0.29 for offsprings， 0.39 and 0.35 for the parents， respectively）. Functional analysis for J. curcas genes with different fully methylation levels revealed that all were tended to exhibit the enrichment of catalytic activity and protein binding. Compared with the mCCGG full methylation level， CmCGG full methylation level samples were also enriched in macromolecular complexes， organelles cellular components， and enriched in biological processes included development， biological， cellular and metabolic processes. This is of great significance for further revealing the inherent mechanism of maintaining the necessary genetic stability of J. curcas from the perspective of epigenetics.

Keywords： Jatropha curcas; methylation; genetic population

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.03.002

DNA甲基化（DNA methylation）是一種在植物雜種優(yōu)勢、環(huán)境適應(yīng)性、生長發(fā)育等方面意義重大的表觀遺傳修飾標記[1-3]。DNA甲基化是指胞嘧啶中的5位碳原子上通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用，增加一個新的甲基基團，構(gòu)成5-甲基胞嘧啶（5mC）的過程[4]。研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化可以改變基因組的功能[3]，對種子萌發(fā)、花期調(diào)控、移栽表現(xiàn)等都有很大影響[5]，另外，DNA甲基化修飾可以通過調(diào)節(jié)基因表達，在植物生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。隨著DNA甲基化的研究不斷深入，越來越多的學者證實DNA甲基化在雜種優(yōu)勢形成過程也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，雙親基因組的組合可導致雜種基因組的不穩(wěn)定性、表觀遺傳以及基因表達變化，影響雜種中表型的變化[6]。

麻瘋樹（Jatropha curcas L.）屬于大戟科麻瘋樹屬植物[7]，原產(chǎn)于墨西哥和中美洲，主要分布在熱帶、亞熱帶和干熱河谷地區(qū)[8]。在我國分布于云南、廣西、廣東、四川、貴州、臺灣、福建等地[9]。其種仁含油率高達40%～60%，種仁油化學成分包含亞油酸、油酸等，是含油樹種中最高的潛在重要生物能源植物之一[10-12]。但與其他油料作物相比，其表觀遺傳研究還處于早期階段。本研究以1組親緣關(guān)系較遠且差異較大的麻瘋樹雜交子代及其雙親為研究試材，采用具有高性價比，且能高效檢測全基因組CCGG DNA甲基化的混合雙酶切（amplified-fragment single nucleotide polymorphism and methylation，AFSM）檢測技術(shù)[13]，通過挖掘麻瘋樹雜交子代及雙親基因組DNA甲基化特征，對群體中具有不同甲基化水平樣品進行功能分析比較，揭示麻瘋樹雜交后代的基因組DNA變化特征，從而為表觀遺傳調(diào)控麻瘋樹雜種優(yōu)勢形成的分子機制提供理論基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

來源于海南和云南麻瘋樹種質(zhì)YN049和H001-31-1雜交構(gòu)建的麻瘋樹遺傳群體，在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院海南省澄邁縣實驗基地種植。采集該麻瘋樹遺傳群體中，包括親本和雜交子代共152份樣品新鮮葉片，液氮保存。

1.2 ?方法

1.2.1 ?高質(zhì)量基因組DNA提取 ?采用DNeasy Plant Kit試劑盒提取麻瘋樹的高質(zhì)量基因組DNA，AFSM方法建庫。RNase處理后，采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的純度，用NanoDrop ND-1000（Nanodrop Technologies， USA）測定基因組DNA的純度和濃度。樣品均一化至100 ng/μL，置于?70 ℃保存。

1.2.2 ?制備AFSM標簽序列和接頭 ?在1.5 mL離心管中加入300 μL“Barcodes”Adapter_1和300 μL“Barcodes”Adapter_2，充分混勻后95 ℃ 2 min，再降溫至25 ℃（?0.1 ℃/s），25 ℃ 30 min制備標簽接頭。另取2個1.5 mL離心管，一管中加入300 μL“MspI-Methylation”Adapter_1和300 μL“MspI-Methylation”Adapter_2，另一管中加入300 μL“HpaII-Methylation”Adapter_1和300 μL“HpaII-Methylation”Adapter_2。充分混勻后95 ℃ 2 min，再降溫至25 ℃（?0.1 ℃/s），25 ℃ 30 min，分別制備好Msp I和Hpa II接頭。4 ℃短期保存，?20 ℃長期保存。

1.2.3 ?麻瘋樹雜交群體及雙親基因組AFSM分析 ?利用AFSM方法[13]進行建庫。在A和B兩個酶切反應(yīng)池中分別利用EcoRⅠ/MspⅠ和EcoR I/HpaⅡ這2對酶對麻瘋樹的基因組DNA進行雙酶切。之后分別將10 μL的A、B酶切產(chǎn)物加入連接反應(yīng)池A和B中進行連接反應(yīng)，酶切產(chǎn)物分別在其兩端，一端加上EcoR I標簽接頭，另一端加上MspⅠ或者HpaⅡ接頭。標簽接頭用于區(qū)分麻瘋樹群體中的不同樣品。將EcoR I-MspⅠ和EcoR I-HpaⅡ兩個基因池中連接產(chǎn)物分別等量混合為A和B兩管，再利用OMEGA的Pure-cycle kit分別對EcoR I-MspⅠ和EcoR I-HpaⅡ混合基因池連接產(chǎn)物進行純化。純化后的產(chǎn)物進行選擇性PCR擴增。

擴增產(chǎn)物取8 μL通過2%瓊脂糖膠檢測是否有富集目的區(qū)域產(chǎn)物，初步確定2種庫的建庫質(zhì)量。確定有富集目的區(qū)域產(chǎn)物后等量混合2種庫，并用E.Z.N.A. Gel Extraction Kit（Omega Bio-tek， Inc.， US， D2500-1）回收純化250～500 bp產(chǎn)物。除利用2%凝膠電泳檢測文庫目的片段是否富集外，對膠回收產(chǎn)物進行純化、Sanger測序檢測進行建庫質(zhì)量評估。評估合格的樣品進行Illumina Highseq2500混合雙端測序。

1.2.4 ?甲基化數(shù)據(jù)挖掘及分析 ?先對麻瘋樹群體的測序原始數(shù)據(jù)進行測序數(shù)據(jù)質(zhì)控和過濾。拼接組裝后用AFSMmeth_xia_V_1.0 pl軟件挖掘甲基化位點，并區(qū)分其全甲基化和半甲基化獲取其豐度信息，比較不同樣品甲基化水平。對所有甲基化位點進行功能注釋，對不同甲基化水平樣品進行功能分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?麻瘋樹高質(zhì)量基因組DNA提取及AFSM建庫

用DNeasy Plant Kit試劑盒提取高質(zhì)量DNA，所有的DNA的OD260/280值為1.8～2.0，且OD260/230值>2.0。并將DNA樣品濃度均一化定量到100 ng/μL。AFSM方法的依據(jù)同裂酶具有相同的酶切識別位點，但對甲基化敏感程度不同的原理，對基因組DNA進行混合雙酶切，以高效檢測全基因組DNA甲基化位點。HpaⅡ?qū)τ贒NA雙鏈的甲基化不能酶切，但它可以識別僅一條鏈上胞嘧啶甲基化的位點。而MSPⅠ可以識別DNA單鏈或雙鏈上該位點內(nèi)側(cè)甲基化的胞嘧啶，但不識別外側(cè)甲基化胞嘧啶，即不能酶切mCCGG的位點。根據(jù)群體中不同樣品所有片段識別其CCGG位點，并獲取酶切信息和reads數(shù)，以及甲基化類型和豐度。采用該方法可以得到適用于二代測序平臺的帶有標簽序列和接頭的DNA片段庫。

在酶切池A和B中分別進行EcoR I/Msp I和EcoR I/Hpa II混合雙酶切，過夜連接標簽序列和接頭。連接產(chǎn)物純化后分別在反應(yīng)池A和B中進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)后擴增通過瓊脂糖凝膠電泳可以看到彌散且在100～750 bp出現(xiàn)明顯富集的擴增條帶。確定有富集目的區(qū)域產(chǎn)物后等量混合兩種庫，并用E.Z.N.A. Gel Extraction Kit（Omega Bio-tek， Inc.， US， D2500-1）回收純化250～500 bp產(chǎn)物。

對膠回收產(chǎn)物進行挑克隆測序檢測。10 μL連接反應(yīng)體系中加入PGEM-T載體1 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，T4 DNA Ligase Buffe 1 μL，和7 μL膠回收產(chǎn)物，混勻后16 ℃過夜連接。再將10 μL連接產(chǎn)物加入到100 μL DH5α感受態(tài)細胞中，用槍頭輕輕攪勻，放置到冰上，冰浴30 min，轉(zhuǎn)入42 ℃水浴鍋，熱激90 s，冰中孵育3 min，取出后加入500 μL液體LB培養(yǎng)基，放到37 ℃搖床上180 r/min 45 min，將搖好的菌液取200 μL涂在含有100 mg/L Amp的LB固體培養(yǎng)基上，倒置放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h左右。挑選15個生長較好的單克隆菌液分別放入裝有500 μL含有100 mg/L Amp的液體LB培養(yǎng)基的離心管中，放入37 ℃搖床，250 r/min搖8 h。結(jié)束后進行菌液PCR鑒定?？梢钥吹絇CR后這些插入載體的DNA片段大小不同，大小均為隨機，且在250～500 bp之間。每排挑選3～7個菌液，進行Sanger測序。對于Sanger測序得到的數(shù)據(jù)，在NCBI網(wǎng)站中進行BLAST比對。通過Sanger測序檢測到兩端的標簽和接頭序列，進一步證明了麻瘋樹的AFSM庫建庫合格，達到了建庫要求。

2.2 ?麻瘋樹甲基化位點挖掘

通過凝膠檢測和挑克隆測序檢測建庫合格的兩組PCR產(chǎn)物A和B等量混合后，利用高通量Hiseq2500進行混合雙端測序。在麻瘋樹群體中檢測出了537 231個 CCGG甲基化位點，其中親本中有10 085個，均值為5042.50，而雜交子代中有527 146個，均值為263 573（圖1）。全甲基化位點中mCCGG甲基化位點有69 068個，CmCGG甲基化位點有125 828個。群體中CmCGG全甲基化位點高于mCCGG全甲基化位點。

HN001-31-1和YN049X中分別有1123和410個mCCGG全甲基化位點。F1子代中mCCGG全甲基化位點數(shù)最高有2888個（樣品097），最少有114個（樣品114）。圖1為3種甲基化模式每個樣品的甲基化數(shù)量，樣品編號151和152分別為親本HN001-31-1和YN049X。其中有11份樣品mCCGG全甲基化程度高于親本HN001-31-1，而62份樣品mCCGG全甲基化程度高于親本YN049X（圖1A）。HN001-31-1和YN049X中分別有4233和1943個mCCGG半甲基化位點。F1子代中mCCGG半甲基化位點數(shù)最高有10641個（樣品097），最少有294個（樣品038），其中有15份樣品mCCGG半甲基程度高于親本HN001-31-1，而70份材料mCCGG半甲基化程度高于親本YN049X（圖1B）。HN001-31-1和YN049X中分別有1533和843個CmCGG全甲基化位點。F1子代中CmCGG全甲基化位點數(shù)最高有4269個（樣品069），最少有119個（樣品070），其中15份樣品CmCGG全甲基化程度高于親本HN001-31-1，而有51份樣品CmCGG全甲基化程度高于親本YN049X（圖1C）。

2.3 ?麻瘋樹群體全甲基化水平

不同甲基化類型的甲基化reads頻率，該位置如發(fā)生甲基化用“M reads”表示，否則表示為“uMreads”，用“M reads”除以覆蓋該位置的總reads總數(shù)，然后用加權(quán)計算，通過每個位點的測序深度，每個位點對一個區(qū)域中的水平的貢獻，以計算全基因組中加權(quán)甲基化水平[13]。本研究中發(fā)現(xiàn)總的DNA甲基化水平在雜交子代（0.29）中顯著低于兩親本（0.39和0.35）。

將本研究中甲基化水平由低到高分為a～d四個等級，其中≤0.20的甲基化水平劃分為a級;0.20<甲基化水平≤0.40劃分為b級;0.40<甲基化水平≤0.60劃分為c級;0.60<甲基化水平≤0.80劃分為d級。從圖2可見，兩親本中YN049X mCCGG全甲基化水平為0.52，而HN001-31-1 mCCGG全甲基化水平為0.69，mCCGG全甲基化水平在HN001-31-1中高于YN049X，而CmCGG全甲基化水平在YN049X中略高于HN001-31-1。樣品130具有最高的mCCGG全甲基化水平，而樣品053具有最高的CmCGG全甲基化水平。樣本068、028、015、058號mCCGG全甲基化水平低于CmCGG全甲基化水平（mCCGG全甲基化類型為a級甲基化水平，而CmCGG全甲基化類型為b級甲基化水平）。

通過agiGO（http：//systemsbiology.cau.edu.cn/ agriGOv2/index.php）對群體中不同mCCGG全甲基化水平樣品的GO富集分析比較發(fā)現(xiàn)，相對于群體中最低甲基化水平樣品68和較高甲基化水平樣品HN001-31-1，群體中最高mCCGG全甲基化水平樣品130號主要富集于對刺激響應(yīng)（response to stimulus）、生物過程調(diào)節(jié)（regulation of biological process）、生物調(diào)節(jié)（biological regulation）、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性（nucleic acid binding transcription factor activity）。3種不同mCCGG全甲基化水平樣品均有富集于催化活性（catalytic activity）和蛋白結(jié)合（binding）等（圖3A～圖3C，表1）。

而在不同CmCGG全甲基化水平樣品中，相對于群體中最低CmCGG全甲基化水平樣品117，較高CmCGG全甲基化樣品HN001-31-1甲基化富集于細胞信號（signaling）、運輸活性（transporter activity）、生物過程調(diào)節(jié)（regulation of biological process）、生物調(diào)節(jié)（biological regulation）等生物學過程，以及膜（membrane）和膜組分（membrane part）等細胞組分。3種不同CmCGG全甲基化水平樣品117、HN001-31-1和053均富集于細胞器（organelle）等細胞組分以及催化活性（catalytic activity）、蛋白結(jié)合（binding），以及細胞過程（cellular process）、代謝過程（metabolic process）等生物學過程（圖3D～圖3F，表1）。

3 ?討論

DNA甲基化通過修飾DNA胞嘧啶調(diào)控基因表達，特別是在轉(zhuǎn)錄起始階段，對于維持植物基因組的穩(wěn)定性以及影響植物生長發(fā)育起著重要作用。常用DNA甲基化敏感擴增多態(tài)性（methylation-ensitive amplified polymorphism，MSAP）方法進行檢測。依靠擴增2種同裂酶切后的基因組產(chǎn)生的條帶，來推斷甲基化數(shù)以及甲基化類型，主要特點在于使用具有不同甲基化敏感性的同分異構(gòu)體（例如HpaⅡ和MspⅠ）作為頻繁切割的限制酶[14]，但是MSAP技術(shù)也有一定局限性，條帶模式容易受到影響，難以統(tǒng)一標準，在某些情況下，MspⅠ和HpaⅡ酶切反應(yīng)間的不同可能是由限制性酶切不一致或PCR反應(yīng)的差異造成，而并不是因為甲基化差異性所致[15]。AFSM方法利用混合雙酶切，且在酶切片段兩端加上標簽序列和接頭來區(qū)分不同的樣品，可以高效地一次檢測出大量樣品的全基因組CCGG甲基化位點，具有低成本、高效、易操作、高性價比等優(yōu)點[13]。本實驗利用AFSM方法進行建庫，通過PCR產(chǎn)物富集、單克隆菌液PCR，以及對單克隆測序檢測其標簽序列和接頭通過了建庫的質(zhì)量檢測評估，再通過二代測序在麻瘋樹遺傳群體中檢測出537 234個甲基化位點，同時還在群體中區(qū)分了全甲基化和半甲基化類型、群體中分布情況及其甲基化水平。

對不同全甲基化水平的樣品進行功能分析發(fā)現(xiàn)均富集于催化活性（catalytic activity）和蛋白結(jié)合（binding），而相對于mCCGG全甲基化水平，CmCGG全甲基化水平樣品甲基化還富集于細胞組分中的大分子復合物（macromolecular complex），以及發(fā)育過程（developmental process）、生物過程（organismal process）等生物學過程。mCCGG全甲基化類型中相比高甲基化水平樣本130，低甲基化水平樣品068的甲基化基因在催化活性和蛋白結(jié)合分子功能有更加明顯的富集，然而高甲基化水平樣本130的甲基化基因在核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性分子功能、刺激響應(yīng)和生物調(diào)節(jié)等生物學過程有明顯富集。CmCGG全甲基化類型中低甲基化水平樣品117和高甲基化水平樣品053中基因均明顯富集于代謝過程和細胞過程生物學過程。相對于低甲基化水平樣品117，高甲基化水平樣品053甲基化基因還富集于生物學過程中的發(fā)育過程、多細胞生物過程。

總體來看，麻瘋樹雜交子代基因組DNA甲基化水平（0.29）明顯低于兩親本甲基化水平的中親值（0.37），發(fā)生了大規(guī)模甲基化模式的調(diào)整。其中兩親本HN001-31-1和YN049X的mCCGG全甲基化程度分別高于93%和59%的雜交子代，親本HN001-31-1和YN049X mCCGG半甲基化程度分別高于90%和54%雜交子代，而親本HN001-31-1和YN049X的CmCGG全甲基化程度分別高于90%和67%雜交子代。有研究者進行了大豆葉片的甲基化研究[16]，實驗結(jié)果中雜種F1的甲基化水平均低于中親值，雜種F1大多較親本發(fā)生了甲基化降低的現(xiàn)象。該變化規(guī)律進一步說明了麻瘋樹在雜交過程中，雜交子代通過調(diào)整DNA甲基化水平及模式，以應(yīng)對基因組融合的沖擊，從而維持群體的遺傳穩(wěn)定性。

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責任編輯：黃東杰

收稿日期 ?2020-04-19;修回日期 ?2020-05-06

基金項目 ?海南省自然科學基金項目（No. 319QN303）;滇桂黔石漠化地區(qū)特色作物產(chǎn)業(yè)發(fā)展關(guān)鍵技術(shù)集成示范項目（No. SMH2019-2021）;中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院基本科研業(yè)務(wù)費專項資金（No. 1630052019022）。

作者簡介 ?張辰笈（1995—），女，碩士，研究方向：作物學。*通信作者（Corresponding author）：王文泉（WANG Wenquan），E-mail：wangwenquan@itbb.org.cn。