斜葉黃檀精油脂質(zhì)體的制備及其抑制黑色素合成的研究

周偉　何云俠　廖良坤　李艷　付調(diào)坤　李如一　李積華　阮榕生

摘 ?要：研究不同濃度斜葉黃檀精油（0、5、10、15、20 mg/L）對制備的脂質(zhì)體穩(wěn)定性及其抑制斑馬魚胚胎黑色素合成的影響。通過粒徑、多分散系數(shù)、Zeta電位、包封率指標來表征斜葉黃檀精油脂質(zhì)體，評價其在4 ℃下儲藏4周的穩(wěn)定性。結果發(fā)現(xiàn)，10 mg/L的斜葉黃檀精油脂質(zhì)體在儲藏過程中最為穩(wěn)定，包封率達到最大，為45.10%±0.27%。斜葉黃檀精油脂質(zhì)體可呈濃度依賴式的降低斑馬魚胚胎的酪氨酸酶活性和黑色素含量;20 mg/L的斜葉黃檀精油脂質(zhì)體對斑馬魚胚胎的酪氨酸酶活性和黑色素含量的抑制作用與30 mg/L的斜葉黃檀精油的效果無顯著差異。本研究構建了相對穩(wěn)定的斜葉黃檀精油脂質(zhì)體載體，研究了斜葉黃檀精油脂質(zhì)體的褪黑效果，為斜葉黃檀精油脂質(zhì)體作為皮膚增白劑的開發(fā)和利用提供了理論基礎。

關鍵詞：斜葉黃檀精油;脂質(zhì)體;斑馬魚胚胎;黑色素;酪氨酸酶

中圖分類號：S377 ? ? ?文獻標識碼：A

Preparation of Dalbergia pinnata （Lour.） Prain Essential Oil Piposomes and Its Inhibition on Melanin Synthesis

ZHOU Wei1，2，3， HE Yunxia2， LIAO Liangkun2，3， LI Yan4， FU Tiaokun2，3， LI Ruyi2，3， LI Jihua2，3*， RUAN Roger1

1. State Key Laboratory of Food Science and Technology / College of Food Science & Technology， Nanchang University， Nanchang， Jiangxi 330047， China; 2. Agricultural Products Processing Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Tropical Crop Products Processing， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Zhanjiang， Guangdong 524001， China; 3. Hainan Key Laboratory of Storage & Processing of Fruits and Vegetables， Zhanjiang， Guangdong 524001， China; 4. College of Tropical Crops， Yunnan Agricultural University， Puer， Yunnan 665099， China

Abstract： The effect of Dalbergia pinnata （Lour.） Prain essential oil concentrations （0， 5， 10， 15， 20 mg/L） on the stability of prepared liposomes and the inhibition of melanin synthesis in zebrafish embryos was studied. The stability of liposome was evaluated by particle size， PDI， Zeta potential and encapsulation efficiency at 4 ℃ for 4 weeks. The results showed that 10 mg/L liposomes were most stable during storage and the encapsulation efficiency reached the maximum 45.10%±0.27%. D. pinnata （Lour.） Prain essential oil liposome could reduce the tyrosinase activity and melanin content of zebrafish embryos in a concentration-dependent manner. And the inhibition of 20 mg/L D. pinnata （Lour.） Prain essential oil liposome on the tyrosinase activity and melanin content of zebrafish embryos was not significantly different from that of 30 mg/L D. pinnata （Lour.） Prain essential oil. In this paper， a relatively stable carrier of D. pinnata （Lour.） Prain essential oil was constructed， and the anti-melanogenesis effect of D. pinnata （Lour.） Prain essential oil liposome was studied， which would provide a theoretical basis for the development and utilization of D. pinnata （Lour.） Prain essential oil liposome as a skin whitening agent.

Keywords： Dalbergia pinnata （Lour.） Prain essential oil; liposome; zebrafish embryo; melanin; tyrosinase

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.03.037

斜葉黃檀[Dalbergia pinnata （Lour.） Prain]為豆科黃檀屬植物，主產(chǎn)于廣西、海南等地，其木質(zhì)部富含豐富的芳香樹脂，是有名的傳統(tǒng)香料，與兩粵黃檀一起被民間稱為“降真香”。斜葉黃檀富含肉桂醛、欖香素等化合物，具有多種生物活性，能起到鎮(zhèn)痛、消炎、止血的作用[1]。斜葉黃檀精油[Dalbergia pinnata （Lour.） Prain essential oil]是由斜葉黃檀經(jīng)過萃取提煉而得，是其精華所在，亦可稱作降真香精油[2]。研究表明，斜葉黃檀精油具有褪黑、抗菌、抗氧化等功效[3]。但斜葉黃檀精油與其他植物精油類似，是一種油狀液體，具有易揮發(fā)，難溶于水，對溫度、紫外線敏感，暴露在空氣中易分解等缺點[4]，因此選擇一種合適的載體技術包埋精油十分必要。脂質(zhì)體（liposomes）是磷脂分散在水中形成的一種具有雙分子層結構的封閉囊泡，可包裹親水和親脂性的藥物，對包埋物具有靶向、控釋和保護等作用，逐漸被廣泛應用于化妝品、食品、農(nóng)業(yè)與醫(yī)藥等領域中[5]。通過脂質(zhì)體包埋可提高精油在水中的溶解性，保護其活性物質(zhì)，防止其在運輸過程中被酶和免疫系統(tǒng)破壞，并提高其穩(wěn)定性[6];還具有緩釋作用，延長被包埋物的殺菌作用[7-8]，并提高精油的生物利用度[9-10]。

黑色素的合成是生物體內(nèi)重要的新陳代謝，在其合成的過程中酪氨酸酶起到關鍵作用，酪氨酸酶的異常表達會引起皮膚色素沉著[11]。因此，可通過拮抗酪氨酸酶的催化活性或生物合成來有效地抑制黑色素生成?；谇捌谡n題組對斜葉黃檀精油抑制黑色素生成的活性研究[3]，本文采用乙醇注入法制備不同濃度的斜葉黃檀精油脂質(zhì)體，測定其粒徑、電位、包封率以及儲藏穩(wěn)定性，選出構建較穩(wěn)定斜葉黃檀精油脂質(zhì)體的濃度;采用斑馬魚作為模型生物，通過觀察其形態(tài)及測定酪氨酸酶活性和黑色素含量，探究斜葉黃檀精油脂質(zhì)體在斑馬魚模型中對黑色素生成的抑制活性。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

斜葉黃檀精油：由海南天香文化有限公司提供（海口），磷脂S75（大豆卵磷脂含的磷脂酰膽堿71%和磷脂酰乙醇胺10%）：德國Lipoid公司產(chǎn)品;膽固醇、吐溫80均采購于索萊寶科技有限公司;氫氧化鈉、無水乙醇為分析純：國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品;3，4-二羥基苯丙氨酸（L-DOPA）購于Sigma公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?斜葉黃檀精油脂質(zhì)體的制備 ?采用乙醇注入法制備斜葉黃檀精油脂質(zhì)體[12]，準確稱取磷脂S75：0.5 g，膽固醇：0.1 g，吐溫80：0.128 g，斜葉黃檀精油：0、5、10、15、20 mg/L溶于15 mL乙醇溶液中。取50 mL蒸餾水，50 ℃預熱，將乙醇混合溶液逐滴加入到持續(xù)攪拌的蒸餾水中，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中在45～50 ℃下減壓蒸發(fā)除去乙醇后定容到50 mL，放入超聲波清洗器中超聲20 min，即得到斜葉黃檀精油脂質(zhì)體，未添加斜葉黃檀精油為空白脂質(zhì)體。

1.2.2 ?粒徑、Zeta電位及PDI測定 ?精油脂質(zhì)體和空白脂質(zhì)體用去離子水稀釋10倍，采用馬爾文Zetaszier Nano-ZS測定平均粒徑、多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）以及Zeta電位，樣品測定前于25 ℃下平衡2 min。

1.2.3 ?斜葉黃檀精油脂質(zhì)體包封率的測定 ?參考Peng等[13]的測定方法并稍作修改，將1 mL脂質(zhì)體放入超濾管（分子截留值為100 kDa;Millipore， UK），并用蒸餾水稀釋，然后將脂質(zhì)體樣品以2000 r/min離心10 min（分離脂質(zhì)體和游離的斜葉黃檀精油），通過UV-Vis光譜法（UV 178，日本Shimadzu公司）測定吸光度并利用標準曲線確定未包埋的斜葉黃檀精油濃度。最后通過以下公式計算包封率：包封率=（Wt-Wf）/Wt×100%，其中，Wt為加入的斜葉黃檀精油的含量（mg），Wf為游離的斜葉黃檀精油含量（mg）。

1.2.4 ?斜葉黃檀精油脂質(zhì)體的儲藏穩(wěn)定性 ?將斜葉黃檀精油脂質(zhì)體樣品（上述1.2.1制備）于4 ℃下儲藏4周，每隔1周分別測定其粒徑、Zeta電位、PDI、包封率等指標。

1.2.5 ?斑馬魚胚胎試驗 ?（1）斑馬魚胚胎繁殖及采集。將野生AB型斑馬魚（由廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院的斑馬魚平臺提供）在實驗室循環(huán)水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件為：室內(nèi)保持14 h（亮）/10 h（暗）光照控制，室溫26 ℃，水溫28 ℃。通過自然產(chǎn)卵獲得胚胎，傍晚時將成年斑馬魚按雌雄比1∶1放入孵化盒中，雌雄用隔板分開，次日抽掉隔板，2 h后進行魚卵采集，選取發(fā)育正常的胚胎進行試驗。

（2）斑馬魚胚胎暴露實驗。為了觀察在不同濃度脂質(zhì)體處理下斑馬魚體內(nèi)黑色素生成情況，將收集的胚胎放入含有胚胎水的6孔板中，于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 hpf，將斑馬魚胚胎分別轉(zhuǎn)移到含斜葉黃檀精油（30 mg/L），脂質(zhì)體（0、5、10、15、20 mg/L）的新鮮胚胎水中。48 hpf，使用倒置熒光顯微鏡觀察到不同的黑色素抑制劑對斑馬魚色素沉著的影響[14]，并拍照記錄。

（3）斑馬魚胚胎中酪氨酸酶活性的測定。分別收集不同濃度藥物處理24 h的幼魚，將30個胚胎放入裝有300 μL冷裂解液緩沖液的EP管中，然后在冰浴條件下超聲處理35 s（超聲探頭2 mm，超聲5 s，間斷10 s），之后在4 ℃下以10000 r/min離心15 min。取20 μL粗酶加入到含有180 μL L-DOPA的96板孔中，在37 ℃的黑暗處孵育30 min后，于475 nm下測量吸光度[15]?？瞻讓φ战M的酪氨酸酶相對活性表示為100%，樣品的酪氨酸酶活性表示為與對照組相比的百分數(shù)。每一樣品濃度設3個復孔，取平均值。

（4）斑馬魚胚胎中黑色素含量的測定。將前述“（3）”中離心獲得的沉淀物溶于300 μL NaOH（1 mol/L）中，將EP管口用封口膜封好，95 ℃干浴30 min，用酶標儀在405 nm下測量吸光度。相對黑色素含量表示為：樣品組OD405/空白對照組OD405× 100%。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

每組實驗至少3組平行，實驗結果用平均值±標準差表示，應用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，采用t檢驗。

2 ?結果與分析

2.1 ?斜葉黃檀精油脂質(zhì)體的制備及表征

通過測定粒徑、Zeta電位、PDI及包封率對所制備的不同濃度斜葉黃檀精油脂質(zhì)體進行表征結果見表1。由表1可見，隨著斜葉黃檀精油的濃度不斷增大，其粒徑不斷增加，這可能是由于脂質(zhì)體包裹了更多的精油，從而引起其粒徑增加。Cui等[16]研究發(fā)現(xiàn)隨著包埋的丁香精油的濃度不斷增加，脂質(zhì)體的粒徑也逐漸增加?？瞻字|(zhì)體Zeta電位約為?44.0 mV，而斜葉黃檀精油脂質(zhì)體的Zeta電位的絕對值均小于空白脂質(zhì)體的，Zeta電位的差異可能是由于斜葉黃檀精油插入到脂質(zhì)膜中造成的。因為在脂質(zhì)體囊泡形成過程中，囊泡的穩(wěn)定性和磷脂的分布受到磷脂磷酸端大小、磷脂親水端極性及精油在膜內(nèi)的堆積等因素的影響[17]。斜葉黃檀精油的添加降低了脂質(zhì)體Zeta電位的絕對值，從而可能會影響脂質(zhì)體的穩(wěn)定性[18]。PDI即多分散系數(shù)，可表示脂質(zhì)體顆粒的均一程度。PDI越大，表明脂質(zhì)體直徑分布越寬，越不均勻;PDI越小，脂質(zhì)體直徑分布越集中、均勻。PDI數(shù)值在0～0.3范圍內(nèi)，表明體系具有均勻的分散性[19]。而制備的斜葉黃檀脂質(zhì)體PDI均在0.2左右，說明其分散性良好。當精油濃度小于10 mg/L時，脂質(zhì)體包封率會隨著精油濃度的升高而增大，當精油濃度增至10 mg/L時，脂質(zhì)體包封率達到最大值，為45.10%±0.27%;然而精油濃度持續(xù)增加時，脂質(zhì)體包封率逐漸下降。這可能是由于斜葉黃檀精油濃度進一步升高，一定量的磷脂形成的脂質(zhì)體對斜葉黃檀精油的包封能力是有限的，這一能力主要與包封物質(zhì)的性質(zhì)有關，當斜葉黃檀精油過多，超過脂質(zhì)膜的飽和度，包封率反而會下降[17]。

2.2 ?斜葉黃檀精油脂質(zhì)體的穩(wěn)定性評價

將脂質(zhì)體在4 ℃下儲藏4周，通過測定粒徑、PDI和Zeta電位指標來考察斜葉黃檀精油脂質(zhì)體的儲藏穩(wěn)定性。從圖1可見，隨著儲藏時間的延長，斜葉黃檀精油脂質(zhì)體的粒徑呈現(xiàn)出不斷增加的趨勢。尤其是濃度為20 mg/L的脂質(zhì)體增幅最為明顯，儲藏4周后粒徑由原來的214.6 nm增加至573.8 nm;而10 mg/L的脂質(zhì)體粒徑增幅最小，由原來的204.4 nm增加至273.9 nm。Zeta電位是表征膠體分散系穩(wěn)定性的重要指標，Zeta電位絕對值越大，體系越穩(wěn)定，即溶解或分散可以抵抗聚集[20]。保存4周后，斜葉黃檀精油脂質(zhì)體均保持負電荷，Zeta電位的絕對值在30～40 mV左右，表明其均相對穩(wěn)定。10 mg/L的斜葉黃檀精油制備的脂質(zhì)體的粒徑變化幅度最小，電位的絕對值約為30～40 mV，無顯著變化，PDI約為0.2～0.3，說明所制備的脂質(zhì)體的體系在儲藏過程中具有良好的穩(wěn)定性。

2.3 ?斜葉黃檀精油脂質(zhì)體對黑色素合成的影響

2.3.1 ?斜葉黃檀精油脂質(zhì)體對斑馬魚黑色素細胞的形態(tài)學影響 ?將24 hpf的斑馬魚胚胎經(jīng)過斜葉黃檀精油（30 mg/L）及斜葉黃檀精油脂質(zhì)體（0、5、10、15、20 mg/L）處理24 h，結果見圖2?？瞻讓φ战M中，在斑馬魚胚胎的脊柱，眼睛和卵黃囊的上下兩側(cè)可明顯觀察到大量的黑點，這是沉積在斑馬魚胚胎中的黑色素。與對照組相比，用斜葉黃檀精油脂質(zhì)體處理24 h的斑馬魚胚胎的黑色素生長都有不同程度的減少，且隨著脂質(zhì)體中斜葉黃檀的含量不斷增加，其黑色素的總量是逐漸減少的。尤其是用20 mg/L的斜葉黃檀精油脂質(zhì)體處理的斑馬魚，其黑色素明顯減少，沒有明顯的黑色素沉著點。同時可以看出，用30 mg/L的斜葉黃檀精油處理的斑馬魚，無論從背面還是側(cè)面觀察，黑色素含量明顯下降，且其黑色素沉著與20 mg/L的斜葉黃檀精油脂質(zhì)體樣品處理的斑馬魚差別不大。

2.3.2 ?精油脂質(zhì)體對斑馬魚胚胎酪氨酸酶活性和相對黑色素含量的影響 ?斜葉黃檀精油脂質(zhì)體對斑馬魚黑色素細胞酪氨酸酶活性具有抑制作用，隨著脂質(zhì)體中斜葉黃檀精油濃度的不斷增加，酪氨酸酶的活性逐漸降低，與空白對照組相比，當濃度為0 mg/L時，差異不顯著;5～20 mg/L處理組酪氨酸酶的活性均被顯著抑制（圖3A）。與空白對照組相比，當脂質(zhì)體濃度為5～20 mg/L時，均顯著抑制了斑馬魚的黑色素生成，且作用呈濃度依賴性，當濃度為20 mg/L時，其抑制作用最強（圖3B）。同時可以看出，用20 mg/L的精油脂質(zhì)體所處理的斑馬魚黑色素含量與用30 mg/L的精油處理的斑馬魚無顯著差異，說明經(jīng)脂質(zhì)體包裹后的斜葉黃檀精油抑制黑色素合成的效果顯著增強。

3 ?討論

脂質(zhì)體是通過磷脂和膽固醇在水性介質(zhì)中的自組裝形成的具有封閉雙層結構的球形囊泡，其具有生物相容性，可生物降解，非免疫原性且無毒。采用脂質(zhì)體包裹斜葉黃檀精油，可有效改善其溶解度和化學穩(wěn)定性，從而提高其生物利用性[21]。

本研究利用脂質(zhì)體對斜葉黃檀精油進行包埋，以提高其理化穩(wěn)定性和精油的生物利用率。通過對粒徑、電位、PDI、包封率等指標的考察，發(fā)現(xiàn)當脂質(zhì)體包埋的斜葉黃檀精油濃度為10 mg/L時，制備的脂質(zhì)體平均粒徑為（204.4±3.6）nm，Zeta電位為（?35.0±0.7）mV，PDI為0.213±0.029，包封率達到最大值45.10%±0.27%，各項指標較為理想。經(jīng)過4周的穩(wěn)定性實驗表明，10 mg/L脂質(zhì)體的粒徑變化幅度最小，Zeta電位和PDI均無顯著性變化，說明所制備的脂質(zhì)體的體系相對比較穩(wěn)定。趙呈婷等[22]采用波薄膜-超聲分散法制備了丁香精油脂質(zhì)體，通過研究發(fā)現(xiàn)當丁香精油濃度為5 mg/mL時，其穩(wěn)定性最好。通過原子力顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)丁香精油脂質(zhì)體的顆粒分散均勻、無明顯聚集現(xiàn)象，而且丁香精油脂質(zhì)體具有長效殺菌作用。

斑馬魚因全身條紋似斑馬而得名，屬于輻鰭亞綱鯉科短擔尼魚屬。斑馬魚擁有與人類相似的黑素細胞和黑素體，因周身透明，色素細胞在個體發(fā)育過程中易被識別、觀察，而且斑馬魚屬低溫低氧魚，飼養(yǎng)容易，產(chǎn)卵量大，具有較強的耐寒性和耐熱性，因此在黑素細胞相關研究中有不可替代的作用[23-24]。因此，本研究以斑馬魚為動物模型，以L-DOPA為底物，測定斜葉黃檀精油脂質(zhì)體對酪氨酸酶活性和黑色素合成的影響。結果表明，斜葉黃檀精油脂質(zhì)體可顯著抑制斑馬魚胚胎的酪氨酸酶活性以及黑色素的沉著，且20 mg/L的斜葉黃檀精油脂質(zhì)體對斑馬魚胚胎的酪氨酸酶活性和黑色素含量的抑制作用與30 mg/L的斜葉黃檀精油的效果無顯著差異。本研究為制備更加穩(wěn)定且更好生理活性的斜葉黃檀精油載體劑型提供了理論指導，對其在制藥和化妝品工業(yè)中用作皮膚增白劑提供了一個新的選擇。

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責任編輯：沈德發(fā)

收稿日期 ?2020-04-21;修回日期 ?2020-05-21

基金項目 ?海南省自然科學基金項目（No. 220RC701）;中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院基本科研業(yè)務費專項（No. 1630122017017）;以農(nóng)業(yè)領域為單元的廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)共性關鍵技術研發(fā)創(chuàng)新團隊建設項目（No. 2019KJ117）。

作者簡介 ?周 ?偉（1987—），男，博士研究生，副研究員，研究方向：熱帶食品加工與貯藏。*通信作者（Corresponding author）：李積華（LI Jihua），E-mail：foodpaper@126.com。