王亞玲 王常安 劉紅柏 陸紹霞 張 穎 徐 喆
(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所,哈爾濱 2150070;2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海 2201306;3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院,無(wú)錫 2214000)
蛋白質(zhì)是魚類飼料中最重要也是最昂貴的成分[1]。從本質(zhì)上講,動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的需求實(shí)質(zhì)是對(duì)氨基酸的需求,蛋白質(zhì)中的氨基酸主要影響魚類的生長(zhǎng)發(fā)育、正常的生理功能、氮的代謝和排泄以及魚類的健康[2-3]。而氨基酸只能直接或間接從食物中獲取,當(dāng)飼料蛋白質(zhì)中的1種或數(shù)種必需氨基酸不足時(shí),魚類利用飼料蛋白質(zhì)的效率降低,正常的生理功能受阻,影響生長(zhǎng)和發(fā)育[4]。魚粉因其具有蛋白質(zhì)含量高,長(zhǎng)鏈脂肪酸、必需氨基酸、維生素和礦物質(zhì)含量豐富等優(yōu)點(diǎn),一直以來(lái)都是水生動(dòng)物的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)源之一[5],但是近幾年來(lái),由于日益高漲的價(jià)格和有限的魚粉資源,使得水生動(dòng)物的魚粉用量不得不減少[6-7]。常用植物蛋白質(zhì)源替代魚粉,如玉米蛋白粉、小麥面筋、豆粕、菜籽粕等,但往往出現(xiàn)必需氨基酸缺乏或含量很低,容易引起飼料中氨基酸不平衡,從而導(dǎo)致水生動(dòng)物不能高效利用飼料蛋白質(zhì)或氨基酸,影響機(jī)體的相關(guān)代謝[8-9]。蘇氨酸為高梁[10]和小麥粉[11]的第二限制性氨基酸,玉米的第三限制性氨基酸[12],逐漸成為影響魚類生長(zhǎng)性能的限制性氨基酸。當(dāng)缺乏蘇氨酸造成氨基酸不平衡時(shí),即使添加其他氨基酸,也很難提高生長(zhǎng)性能[13-15]。在鯉魚(Cyprinuscarpio)[16]、遮目魚(Chanoschanos)[17]的研究中發(fā)現(xiàn)蘇氨酸缺乏時(shí),死亡率升高;在乳豬蘇氨酸不足或缺乏時(shí),會(huì)引起生理失衡以及與蛋白質(zhì)合成和能量代謝相關(guān)基因的變化;在陸生動(dòng)物如家禽、豬和牛上也有大量蘇氨酸缺乏癥相關(guān)報(bào)道[18-20]。因此,進(jìn)一步研究蘇氨酸顯得尤為重要[21]。
虹鱒(Oncorhynchusmykiss)屬鮭形目(Salmoniformes),鮭科(Salmonidae),大麻哈魚屬(Oncorhynchus),因其富含不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)含量較高、易加工、無(wú)肌間刺等特點(diǎn),成為各國(guó)受歡迎的健康食品。三倍體虹鱒是基于遺傳特性和生產(chǎn)實(shí)踐而產(chǎn)生的多倍體虹鱒,與普通二倍體相比具有生長(zhǎng)速度快、個(gè)體大、抗病性強(qiáng)、肉質(zhì)細(xì)膩和養(yǎng)殖周期短等優(yōu)勢(shì),成為世界上最為廣泛的養(yǎng)殖魚類之一,國(guó)內(nèi)占世界虹鱒養(yǎng)殖量的80%以上[22-23]。目前,虹鱒和鮭鱒對(duì)蘇氨酸的需求量已有研究報(bào)道[24-25],研究發(fā)現(xiàn)虹鱒和大西洋鮭在魚苗階段對(duì)蘇氨酸的需求量相似[26],然而在低魚粉飼料中添加蘇氨酸對(duì)三倍體虹鱒的研究較少。因此,本試驗(yàn)旨在研究低魚粉飼料中添加蘇氨酸對(duì)三倍體虹鱒生長(zhǎng)性能、體成分及氨基酸組成的影響,為三倍體虹鱒人工高效配合飼料的配制提供理論依據(jù)。
基礎(chǔ)飼料為半純化飼料,以糊精為糖源,魚粉、豆粕、明膠為蛋白質(zhì)源,魚油、豆油和磷脂為脂肪源配制粗蛋白質(zhì)水平為41.54%,粗脂肪水平為18.68%的基礎(chǔ)飼料[27]。在基礎(chǔ)飼料中分別添加不同水平的L-蘇氨酸(Sigma,純度98%),配制蘇氨酸水平分別達(dá)到0.45%(G1,對(duì)照)、0.76%(G2)、1.09%(G3)、1.29%(G4)、1.64%(G5)的5種等氮等脂的試驗(yàn)飼料,其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1,其中蘇氨酸水平的增減用等量的甘氨酸代替,試驗(yàn)飼料氨基酸組成見表2。所有原料粉碎后經(jīng)過(guò)80目篩,按照配方稱重,逐級(jí)混合均勻后經(jīng)小型制粒機(jī)HKJ-218(無(wú)錫同力糧機(jī)有限公司)加工成直徑為3 mm的顆粒飼料,風(fēng)干后裝袋,置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))
續(xù)表1項(xiàng)目 Items飼料 DietsG1G2G3G4G5合計(jì) Total100.00100.00100.00100.00100.00營(yíng)養(yǎng)水平 Nutrient levels4)總能 Gross energy/(MJ/kg)5.075.075.075.075.07粗蛋白質(zhì) Crude protein41.5441.5441.5441.5441.54粗脂肪 Crude lipid18.6818.6818.6818.6818.68
表2 試驗(yàn)飼料氨基酸組成(干物質(zhì)基礎(chǔ))
試驗(yàn)在中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所進(jìn)行。在試驗(yàn)開始時(shí),選取同一批魚苗,放入水族箱中適應(yīng)2周,在適應(yīng)期間,基礎(chǔ)飼料(G1)飽食投喂,使之能夠逐漸適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境和試驗(yàn)飼料。試驗(yàn)開始時(shí),試驗(yàn)魚饑餓24 h,選取初始體質(zhì)量為(18.42±0.20) g、規(guī)格一致的健康三倍體虹鱒隨機(jī)分配到15個(gè)200 L的流水水族箱中。試驗(yàn)分為5組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)30尾試驗(yàn)魚,分別飼喂G1、G2、G3、G4、G5飼料,每天投喂2次(09:00和16:00),達(dá)飽食,養(yǎng)殖周期56 d。試驗(yàn)期間自然光照,水源為曝氣自來(lái)水,水溫(15±1) ℃,溶氧含量>6.0 mg/L,氨氮含量<0.2 mg/L,pH 7.0~7.2,每天記錄投飼量,如有死魚稱重并記錄數(shù)量。
1.3.1 采樣
養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后,虹鱒饑餓24 h,分別從每個(gè)水族箱中隨機(jī)取3尾虹鱒,每組9尾,用100 mg/L MS-222麻醉,測(cè)體長(zhǎng),稱量體重,用于全魚常規(guī)養(yǎng)分含量的測(cè)定;再?gòu)拿總€(gè)水族箱中隨機(jī)取4尾魚,放置冰盤上,取背肌于速凍管中,放置到液氮中用于肌肉氨基酸組成的測(cè)定,采樣編好號(hào)后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 生長(zhǎng)性能的測(cè)定
生長(zhǎng)性能指標(biāo)計(jì)算公式如下:
增重率(weight gain rate,WGR,%)=100×
(Wt-W0);
特定生長(zhǎng)率(specific growth rate,SGR,%/d)=
100×(lnWt-lnW0)/t;
蛋白質(zhì)效率(protein efficiency ratio,PER)=(Wt-
W0)/(Wf×飼料蛋白質(zhì)含量)。
式中:W0為魚初始體質(zhì)量(g);Wt為魚終末體質(zhì)量(g);Lt試驗(yàn)魚終末體長(zhǎng)(cm);Wf為飼料攝入量(g);t為試驗(yàn)天數(shù)(d)。
1.3.3 營(yíng)養(yǎng)成分含量的測(cè)定
采用烘干法(GB/T 6435—2014),在(105±1) ℃、1個(gè)大氣壓下,在烘箱中烘干直至恒重,測(cè)定樣品中水分的含量;采用半自動(dòng)微量凱氏定氮法(GB/T 6432—2018)測(cè)定粗蛋白質(zhì)含量;采用索氏抽提法(GB/T 6433—2006),以乙醚為抽提劑測(cè)定粗脂肪含量;采用灼燒法(GB/T 6438—2007),在馬弗爐(550 ℃)充分灼燒測(cè)定粗灰分含量。
1.3.4 肌肉氨基酸組成的測(cè)定
魚體肌肉中氨基酸組成采用全自動(dòng)氨基酸分析儀(日立L-8900)測(cè)定。稱量冷凍干燥好的肌肉樣品40~50 mg(精確至0.1 mg),放置50 mL的安瓿瓶中并做好標(biāo)記;加入6 mol/L鹽酸10 mL,迅速封管后放置恒溫干燥箱(110±1) ℃中水解24 h,冷卻后打開安瓿瓶;用超凈水定容到150 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶?jī)?nèi),在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(60 ℃)中抽真空,蒸發(fā)至干;用0.02 mol/L的鹽酸沖洗蒸發(fā)瓶數(shù)次,洗滌液轉(zhuǎn)至10 mL容量瓶中,最后用0.02 mol/L的鹽酸定溶,充分混勻后即為試樣水解液。吸取試樣水解液及混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液2~3 mL,經(jīng)過(guò)濾至自動(dòng)進(jìn)樣瓶中并加蓋,通過(guò)全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行氨基酸含量的檢測(cè)。
使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 23.0進(jìn)行單因素方差分析,經(jīng)過(guò)單因素方差分析后,使用Duncan氏法對(duì)數(shù)據(jù)之間的差異性進(jìn)行多重比較,所有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,以P<0.05為顯著差異性標(biāo)準(zhǔn)。使用Excel 2013軟件,以特定生長(zhǎng)率、蛋白質(zhì)效率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行二次回歸分析,確定三倍體虹鱒對(duì)蘇氨酸的最佳需要量范圍。
由表3可見,試驗(yàn)結(jié)束時(shí),各組間虹鱒的飼料系數(shù)、蛋白質(zhì)效率差異不顯著(P>0.05),3個(gè)試驗(yàn)組虹鱒的終末體質(zhì)量、增重率和特定生長(zhǎng)率相比對(duì)照組顯著升高(P<0.05),肥滿度在G4組最低,G1組最高,2組間差異顯著(P<0.05)。
表3 飼料中添加蘇氨酸對(duì)虹鱒魚生長(zhǎng)性能的影響
如圖1、圖2所示,以飼料中不同蘇氨酸水平為自變量(X),分別以特定生長(zhǎng)率和蛋白質(zhì)效率進(jìn)行二次回歸分析,得出:特定生長(zhǎng)率與蘇氨酸水平之間的回歸方程為y=-0.193 7x2+0.509 6x+1.573 9(R2=0.984 7);蛋白質(zhì)效率與蘇氨酸水平之間的回歸方程為y=-0.1x2+0.239 6x+1.957 8(R2=0.882 0)。如圖1、圖2所示,當(dāng)飼料蘇氨酸水平低于1.3%時(shí),三倍體虹鱒的特定生長(zhǎng)率隨飼料蘇氨酸水平的提高呈上升的趨勢(shì),當(dāng)飼料蘇氨酸水平高于1.3%時(shí),特定生長(zhǎng)率呈下降的趨勢(shì);當(dāng)飼料蘇氨酸水平低于1.2%時(shí),三倍體虹鱒的蛋白質(zhì)效率隨飼料蘇氨酸水平的提高呈上升的變化趨勢(shì),當(dāng)飼料蘇氨酸水平高于1.2%時(shí),蛋白質(zhì)效率呈下降的變化趨勢(shì);當(dāng)蘇氨酸水平為1.2%、1.3%時(shí),三倍體虹鱒的特定生長(zhǎng)率和蛋白質(zhì)效率均有最大值,分別為1.91 %/d、2.10%。
圖1 飼料蘇氨酸水平和虹鱒特定生長(zhǎng)率的回歸分析
圖2 飼料蘇氨酸水平和虹鱒蛋白質(zhì)效率的回歸分析
由表4可見,隨著飼料蘇氨酸水平的增加,虹鱒全魚水分含量有顯著變化(P<0.05),其中G5組顯著低于對(duì)照組(P<0.05);粗蛋白質(zhì)含量隨著飼料蘇氨酸水平的升高呈先升高后降低的變化趨勢(shì);G4組的粗脂肪含量顯著低于其余各組(P<0.05);粗灰分含量各組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。
表4 飼料中添加蘇氨酸對(duì)虹鱒體成分的影響
由表5可見,三倍體虹鱒體內(nèi)氨基酸組成十分豐富,共檢測(cè)到17種氨基酸,飼料中蘇氨酸水平對(duì)三倍體虹鱒肌肉蘇氨酸(Thr)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)、天冬氨酸(Asp)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)含量無(wú)顯著影響(P>0.05)外,對(duì)纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)含量有顯著影響(P<0.05),其中谷氨酸的含量最高,天冬氨酸含量次之,其他氨基酸在G4組的含量相對(duì)較高,絲氨酸含量顯著增高(P<0.05),半胱氨酸含量顯著降低(P<0.05)。
表5 飼料中添加蘇氨酸對(duì)虹鱒肌肉氨基酸組成的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))
本試驗(yàn)中,投喂蘇氨酸缺乏的飼料(蘇氨酸水平為0.45%)后發(fā)現(xiàn),三倍體虹鱒的生長(zhǎng)緩慢,類似的現(xiàn)象在大西洋鮭(Salmosalar)[28]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[29]、歐洲鱸魚(Dicentrarchuslabrax)[30]、南亞野鱗(Catlacatla)[31]等魚類上都有報(bào)道。當(dāng)飼料中蘇氨酸水平不足時(shí),虹鱒的生長(zhǎng)受阻,導(dǎo)致增重率和特定生長(zhǎng)率的數(shù)值相比均偏低,當(dāng)飼料中的蘇氨酸水平提高到1.29%,虹鱒的生長(zhǎng)狀況將得到改善,增重率、特定生長(zhǎng)率有顯著提高。這說(shuō)明當(dāng)飼料中蘇氨酸缺乏時(shí)會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成受阻,影響正常的生長(zhǎng)發(fā)育,也有可能影響抗氧化產(chǎn)物的減少,導(dǎo)致生長(zhǎng)進(jìn)一步加劇停滯。在低魚粉且蘇氨酸缺乏的條件下,將蘇氨酸補(bǔ)充到適宜水平可以改善三倍體虹鱒的生長(zhǎng)性能。以特定生長(zhǎng)率、蛋白質(zhì)效率為評(píng)價(jià)指標(biāo),得出三倍體虹鱒對(duì)蘇氨酸的最適需要量為1.35%~1.48%(占飼料蛋白質(zhì)的2.89%~3.13%),按其占蛋白質(zhì)含量的比較,這一結(jié)果與鮭科魚類如狗大馬哈魚(Oncorhynchusketa)[32]和大西洋鮭(Salmosalar)[33]的3.0%~3.2%相似,高于鮭科魚類的大鱗大馬哈魚(Oncorhynchustshawytscha)[34]、銀大馬哈魚(Oncorhynchuskisutch)[35]的2.0%~2.2%;但低于印度鯉魚(Cirrhinusmrigala)[36]、印鯪(Labeorohita)[37]、遮目魚(Chanoschanos)[17]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[38]的研究結(jié)果(4.30%~4.66%),有研究學(xué)者通過(guò)生長(zhǎng)試驗(yàn)指出虹鱒的蘇氨酸需要量為1.52%(占飼料蛋白質(zhì)的3.4%)[39],與本試驗(yàn)相比,三倍體虹鱒蘇氨酸需要量(2.89%~3.13%)比虹鱒的需要量略低,上述研究所得蘇氨酸需要量不同可能是由于試驗(yàn)魚的種類和大小、基礎(chǔ)飼料組成(純化、半純化、實(shí)用飼料等)、晶體氨基酸、試驗(yàn)設(shè)計(jì)和養(yǎng)殖條件等多個(gè)原因造成差異[40-41]。例如,本試驗(yàn)中的試驗(yàn)魚是三倍體虹鱒,飼料中添加的是15%的魚粉,另外,蘇氨酸的吸收率、添加形式和生物利用效率也會(huì)影響其需要量[42]。當(dāng)飼料中蘇氨酸水平達(dá)到或超過(guò)1.29%時(shí),之后在飼料中進(jìn)一步添加蘇氨酸,三倍體虹鱒的增重率、肥滿度、特定生長(zhǎng)率和蛋白質(zhì)效率的增加速率將有所降低,這與草魚(Ctenopharyngodonidella)[43]、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[44]的研究結(jié)果一致。推測(cè)可能是蘇氨酸過(guò)量時(shí)因排泄和脫氨作用使飼料氨基酸模式不平衡,導(dǎo)致魚類生長(zhǎng)與蛋白質(zhì)沉積降低,此外,氨對(duì)生物體有毒,脫去的氨需要排出體外,消耗額外的能量,引起特定生長(zhǎng)率下降[45-46]。然而,也有研究報(bào)道,飼料蘇氨酸水平升高到適宜水平后魚體的特定生長(zhǎng)率顯著增加,繼續(xù)升高蘇氨酸水平,特定生長(zhǎng)率基本保持不變,后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)[47]。
本試驗(yàn)中,隨著飼料蘇氨酸水平的增加,虹鱒全魚的水分含量顯著降低,在G5組的水分含量最低;G4組的粗脂肪含量最低;粗蛋白質(zhì)含量隨著飼料蘇氨酸水平的增加呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì);粗灰分含量隨著飼料蘇氨酸水平的增加無(wú)顯著變化。胡曉霞等[48]對(duì)生長(zhǎng)中期草魚(Ctenophyngodonidellus)投喂含不同水平蘇氨酸的飼料,發(fā)現(xiàn)蘇氨酸水平能顯著降低生長(zhǎng)中期草魚的水分和粗脂肪含量,極顯著提高粗蛋白質(zhì)的含量。周興華等[49]對(duì)吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)的研究發(fā)現(xiàn),飼料中蘇氨酸水平適宜時(shí),不同水平的蘇氨酸會(huì)顯著降低吉富羅非魚的水分含量,而粗蛋白質(zhì)含量顯著增高,對(duì)粗脂肪和粗灰分含量影響不顯著,這與建鯉(Cyprinuscarpiovarjian)[50]、印度鯰魚(Silurusasotus)[51]、日本對(duì)蝦(Penaeussemisulcatus)[52]的研究結(jié)果一致,隨著飼料蘇氨酸水平的增加,體蛋白質(zhì)含量增加,當(dāng)蘇氨酸水平為1.58%時(shí),體蛋白質(zhì)含量最高。本試驗(yàn)與其結(jié)果相似,說(shuō)明飼料蘇氨酸水平添加不足時(shí),飼料中氨基酸模式出現(xiàn)失衡的現(xiàn)象,使體蛋白質(zhì)合成受阻,最終導(dǎo)致三倍體虹鱒限制利用其他氨基酸的能力,加重多余氨基酸的脫氨基作用,主要利用蛋白質(zhì)而不是脂肪作為能源,而添加適宜水平的蘇氨酸后,增加了三倍體虹鱒對(duì)蘇氨酸的利用,促進(jìn)了體蛋白質(zhì)的合成,使更多的脂肪用于能量消耗。
魚類對(duì)蛋白質(zhì)的積累實(shí)質(zhì)是通過(guò)飼料氨基酸的合成來(lái)實(shí)現(xiàn)的,飼料的氨基酸模式不同,對(duì)魚類蛋白質(zhì)的合成、體蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)氨基酸的組成以及魚類生長(zhǎng)的影響都不同。牙鲆(Paralichthysolivaceus)飼料添加蘇氨酸的研究發(fā)現(xiàn),飼料蘇氨酸水平與全身精氨酸、蘇氨酸和纈氨酸含量呈正相關(guān)關(guān)系[53]。虹鱒飼料蘇氨酸水平升高后,降低了全身賴氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和脯氨酸的含量,增加了全身組氨酸、蛋氨酸和蘇氨酸的含量[26]。隨著飼料中添加蘇氨酸水平提高,增加了大西洋鮭全身精氨酸、蘇氨酸、絲氨酸和酪氨酸的含量[28]。本試驗(yàn)結(jié)果與其相似,隨著飼料中蘇氨酸水平的增加,對(duì)肌肉纈氨酸、亮氨酸、組氨酸、精氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、酪氨酸含量有顯著影響,其中絲氨酸含量顯著增加,半胱氨酸含量顯著降低,其他氨基酸含量呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)。這表明攝入一種氨基酸可能會(huì)影響其他氨基酸含量的改變[42],飼料中必需氨基酸的某一種限制可能會(huì)增加其他必需氨基酸或非必需氨基酸的氧化來(lái)達(dá)到飼料中氨基酸的平衡[54]。
飼料中添加蘇氨酸可以提高三倍體虹鱒的生長(zhǎng)性能,以特定生長(zhǎng)率、蛋白質(zhì)效率為評(píng)價(jià)指標(biāo),經(jīng)過(guò)二次回歸分析可知,三倍體虹鱒對(duì)蘇氨酸的最佳需要量為1.2%~1.3%。
動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)2021年4期