馬秀花 桂瑞麒 焦 娜 楊萬(wàn)宗 李慶敏 周玉香

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 2750021)

反芻動(dòng)物瘤胃的微生態(tài)系統(tǒng)極其復(fù)雜[1-2]，包括細(xì)菌、真菌和原生動(dòng)物，而細(xì)菌是這些微生物中的優(yōu)勢(shì)種群[3]。甘露寡糖(MOS)是一種常見(jiàn)的功能性低聚糖[4]，被稱為“化學(xué)益生素”，可以促進(jìn)動(dòng)物胃腸道內(nèi)有益菌群的增殖[5-6]，改善動(dòng)物胃腸道微生態(tài)環(huán)境，提高免疫力和生產(chǎn)性能[7]，在動(dòng)物飼糧中得到廣泛使用[8]，并已成為多種單胃動(dòng)物研究的主題，包括豬[9-10]、蛋雞[11]、肉雞[12]、家兔[13]，而其在反芻動(dòng)物瘤胃微生物方面的研究較少[14]。普遍認(rèn)為是低聚糖會(huì)被瘤胃微生物降解而不會(huì)對(duì)反芻動(dòng)物飼糧帶來(lái)益處。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，添加不同水平的MOS在不影響綿羊?qū)^大多數(shù)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率、存留率以及瘤胃發(fā)酵、免疫力、血清一氧化氮(NO)濃度和一氧化氮合酶活性的情況下提高了纖維物質(zhì)的表觀消化率[15]，而關(guān)于MOS可提高綿羊纖維物質(zhì)表觀消化率的生理機(jī)理還需要全面去揭示。因此，本研究基于16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)分析蕎麥秸稈飼糧條件下添加不同水平MOS對(duì)灘羊瘤胃細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)與多樣性的影響，為進(jìn)一步研究MOS對(duì)纖維物質(zhì)的影響提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼糧組成

本試驗(yàn)于2019年5—9月在寧夏農(nóng)墾賀蘭山牛羊產(chǎn)業(yè)(集團(tuán))有限公司開展，試驗(yàn)前1個(gè)月對(duì)羊舍做好清潔、防疫工作。

選取健康、體重在30.5 kg左右的寧夏斷奶灘羊羯羊20只，隨機(jī)分為4組，每組5只，獨(dú)籠飼養(yǎng)?；A(chǔ)飼糧參照《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 816—2004)并結(jié)合寧夏灘羊的飼養(yǎng)實(shí)踐進(jìn)行配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。飼糧精粗比為30∶70，全株玉米青貯與蕎麥秸稈以60∶40混合作為粗飼料，其中蕎麥秸稈粉碎后與0.1%纖維素酶、1.0%麩皮混合均勻并密閉發(fā)酵30 d。對(duì)照組(CK-3組)灘羊飼喂基礎(chǔ)飼糧；試驗(yàn)組灘羊飼喂在基礎(chǔ)飼糧基礎(chǔ)上分別添加1%(Y1-3組)、2%(Y2-3組)和3%(Y3-3組)MOS(純度>99%)的試驗(yàn)飼糧，MOS與精料混合均勻，以保證全部MOS被羊只采食。試驗(yàn)期為75 d，其中預(yù)試期15 d，正試期60 d。每天飼喂2次(07：30和17：30)，先喂粗料后喂精料，自由采食和飲水。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 樣品采集

瘤胃液采集：在正試期第60天每組隨機(jī)選擇3只羊用瘤胃導(dǎo)管各采集瘤胃液50 mL，于-80 ℃超低溫保存，待測(cè)瘤胃發(fā)酵參數(shù)和菌群結(jié)構(gòu)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 瘤胃發(fā)酵參數(shù)

使用pHS-2型酸度計(jì)測(cè)定瘤胃液的pH，參照馮宗慈等[16]的方法測(cè)定氨態(tài)氮(NH3-N)含量；采用氣相色譜法測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸含量。

1.3.2 16S rDNA測(cè)序

從樣本中提取基因組DNA后，用帶有barcode的特異引物擴(kuò)增16S rDNA的V3+V4區(qū)，所用引物及引物序列為：341F，5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′；806R，5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′。然后PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收，用QuantiFluorTM熒光計(jì)進(jìn)行定量。將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行等量混合，連接測(cè)序接頭，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，以HiSeq 2500的PE250模式上機(jī)測(cè)序。測(cè)序得到raw reads之后，對(duì)低質(zhì)量reads進(jìn)行過(guò)濾，然后進(jìn)行組裝和過(guò)濾，以保證利用最有效數(shù)據(jù)聚類成操作分類單元(OTUs)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Excel 2010對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行簡(jiǎn)單處理，并在SAS 8.2軟件上進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘤胃發(fā)酵參數(shù)

由表2可知，在本試驗(yàn)條件下，飼糧中添加不同水平的MOS對(duì)試驗(yàn)羊的瘤胃液pH及NH3-N含量無(wú)顯著影響(P>0.05)，以Y2-3組數(shù)值最高。飼糧中添加不同水平的MOS顯著影響瘤胃液乙酸含量(P<0.05)，表現(xiàn)為Y1-3組、Y2-3組顯著高于Y3-3組(P<0.05)，其中以Y2-3組數(shù)值最高。各組間瘤胃液丙酸含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。Y2-3組瘤胃液丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸含量以及乙酸/丙酸均高于其他組，但差異未達(dá)顯著水平(P>0.05)。

表2 瘤胃發(fā)酵參數(shù)

2.2 測(cè)序結(jié)果及其合理性

2.2.1 瘤胃菌群OTUs數(shù)量

測(cè)序共得888 992個(gè)有效序列，用Uparse軟件對(duì)所有樣本的全部有效序列聚類，以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，結(jié)果顯示12個(gè)樣本共產(chǎn)生4 104個(gè)OTUs。由圖1可知，CK-3組有979個(gè)OTUs，Y1-3組有943個(gè)OTUs，Y2-3組有1 184個(gè)OTUs，Y3-3組有998個(gè)OTUs。4組共享372個(gè)OTUs。Y1-3組OTUs相對(duì)CK-3組有所減少，而Y2-3組、Y3-3組OTUs相對(duì)CK-3組有所增加，說(shuō)明不同添加水平的MOS對(duì)灘羊瘤胃菌群豐度的影響不同。

CK-3：CK-3組 CK-3 group；Y1-3：Y1-3組 Y1-3 group；Y2-3：Y2-3組 Y2-3 group；Y3-3：Y3-3組 Y3-3 group。下圖同 the same as below。

2.2.2 稀釋曲線

樣本稀釋曲線如圖2所示，隨著試驗(yàn)測(cè)序深度的增加，各條曲線趨于平緩，表明測(cè)序深度覆蓋了樣本中的大部分微生物。樣本覆蓋度曲線如圖3所示，當(dāng)測(cè)序深度達(dá)50 000 reads時(shí)，覆蓋度>0.99，已至飽和狀態(tài)，表明本試驗(yàn)中測(cè)序飽和，測(cè)序量及測(cè)序深度合理，當(dāng)前的測(cè)序量足夠進(jìn)行菌群多樣性分析。

圖2 樣本稀釋曲線

圖3 樣本覆蓋度曲線

2.3 Alpha多樣性分析

如表3可知，Y1-3組、Y2-3組、Y3-3組的各Alpha多樣性指數(shù)與對(duì)照組均無(wú)顯著差異(P>0.05)，但是總體分析可知Y1-3組、Y2-3組、Y3-3組的菌群豐度較CK-3組提高，且多樣性增加，說(shuō)明添加MOS可在一定程度上提高灘羊瘤胃菌群的多樣性。

2.4 Beta多樣性分析

2.4.1 樣本間物種組成聚類分析

根據(jù)各樣本豐度差異的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，基于遺傳距離矩陣，采用非加權(quán)組平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA)對(duì)樣本進(jìn)行聚類分析。樣本越靠近，枝長(zhǎng)越短，說(shuō)明2個(gè)樣本的物種組成越相似。由圖4可知，與CK-3組樣本的瘤胃菌群構(gòu)成相比差異由大到小依次為Y2-3組、Y1-3組、Y3-3組，說(shuō)明飼糧中添加不同水平的MOS對(duì)灘羊瘤胃菌群組成有不同的影響，飼糧中添加2%MOS時(shí)灘羊瘤胃菌群組成與飼糧不添加MOS時(shí)差異最大。

CK-3-1、CK-3-2、CK-3-3為CK-3組的3個(gè)樣本，Y1-3-1、Y1-3-2、Y1-3-3為Y1-3組的3個(gè)樣本，Y2-3-1、Y2-3-2、Y2-3-3為Y2-3組的3個(gè)樣本，Y3-3-1、Y3-3-2、Y3-3-3為Y3-3組的3個(gè)樣本。

2.4.2 主坐標(biāo)分析(PCoA)

通過(guò)PCoA，可以觀察到個(gè)體或者群體之間的差異。PCo1為第1主成分，表示分離樣品66.39%的方差；PCo2為第2主成分，表示分離樣品17.92%的方差。從圖5可知，與CK-3組相比，Y2-3組、Y3-3組的個(gè)體聚集度較高，而Y1-3組的個(gè)體聚集度降低，說(shuō)明飼糧中添加2%或3%MOS均能使組內(nèi)菌群組成相似性變得更高。Y2-3組的組內(nèi)菌群組成相似性最高且與其他組間差異最大，說(shuō)明飼糧中添加2%MOS對(duì)灘羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)影響最大。

圖5 PCoA圖

2.5 系統(tǒng)分類學(xué)分析

2.5.1 MOS對(duì)灘羊瘤胃菌群在門水平上相對(duì)豐度的影響

將試驗(yàn)得到的有效序列在不同分類水平上進(jìn)行物種注釋及組間統(tǒng)計(jì)分析。如圖6所示，在門水平上共注釋得到12個(gè)菌門，相對(duì)豐度都在0.1%以上。變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為4組灘羊瘤胃菌群中的優(yōu)勢(shì)菌門。其中，變形菌門是CK-3組、Y1-3組和Y3-3組這3組中共享的優(yōu)勢(shì)菌門，而厚壁菌門、擬桿菌門是Y2-3組中的優(yōu)勢(shì)菌門。Y2-3組較其他組極顯著提高了厚壁菌門、擬桿菌門的相對(duì)豐度(P<0.01)，極顯著降低了變形菌門的相對(duì)豐度(P<0.01)，且此組中浮霉菌門(Planctomycetes)、Kiritimatiellaeota、黏膠球形菌門(Lentisphaerae)的相對(duì)豐度也較其他組高(表4)。上述結(jié)果說(shuō)明飼糧中添加不同水平MOS對(duì)灘羊瘤胃菌群中的優(yōu)勢(shì)菌門存在不同的影響，添加2%MOS提高了厚壁菌門、擬桿菌門的相對(duì)豐度，而降低了變形菌門的相對(duì)豐度。

表4 門水平相對(duì)豐度

圖6 門水平物種注釋

2.5.2 MOS對(duì)灘羊瘤胃菌群在屬水平上相對(duì)豐度的影響

為了進(jìn)一步探索不同添加水平的MOS對(duì)灘羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)影響的差異，對(duì)各組菌群進(jìn)行了屬水平上的差異分析，總共得到56個(gè)菌屬，但是由于種類太多且相對(duì)豐度太小，僅對(duì)排名前20的菌屬進(jìn)行分析，圖7為聚類熱圖，綠色越深代表細(xì)菌豐度越小，紅色越深代表細(xì)菌豐度越大。結(jié)合圖7和表5可知，CK-3組Rummeliibacillus、腸球菌屬(Enterococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)的相對(duì)豐度極顯著大于其他組(P<0.01)，不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)的相對(duì)豐度極顯著大于Y1-3組和Y2-3組(P<0.01)。Y1-3組叢毛單胞菌屬(Comamonas)、埃希氏菌屬-志賀菌屬(Escherichia-Shigella)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)的相對(duì)豐度極顯著大于其他組(P<0.01)。Y2-3組賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)、普雷沃氏菌屬1(Prevotella_1)、醋桿菌屬(Acetobacter)、理巖菌科RC9腸道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、克里斯滕森菌科R-7群(Christensenellaceae_R-7_group)、乳球菌屬(Lactococcus)、解琥珀酸菌屬(Succiniclasticum)、瘤胃球菌科NK4A214群(Ruminococcaceae_NK4A214_group)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、小梨形菌屬(Pirellula)的相對(duì)豐度極顯著大于CK-3組(P<0.01)。Y3-3組狹義梭菌屬1(Clostridium_sensu_stricto_1)的相對(duì)豐度極顯著大于其他組(P<0.01)。p-1088-a5_gut_group、甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)的相對(duì)豐度在4組之間差異不顯著(P>0.05)。

表5 屬水平相對(duì)豐度

續(xù)表5項(xiàng)目 Items組別 GroupsCK-3Y1-3Y2-3Y3-3P值P-value理巖菌科RC9腸道群 Rikenellaceae_RC9_gut_group1.62±0.06Bb1.38±0.26Bb3.52±0.56Aa1.63±0.15Bb<0.001克里斯滕森菌科R-7群Christensenellaceae_R-7_group2.14±0.18Bb0.80±0.11Cd2.77±0.36Aa1.23±0.08Cc0.001乳球菌屬 Lactococcus0.08±0.02Bc0.02±0.00Bc4.35±0.46Aa0.60±0.04Bb0.001腸球菌屬 Enterococcus1.63±0.36Aa0.64±0.05Bb0.80±0.12Bb0.88±0.04Bb<0.001解琥珀酸菌屬 Succiniclasticum0.43±0.07BC0.73±0.11Bbc1.67±0.32Aa0.77±0.09Bb<0.001瘤胃球菌科NK4A214群 Ruminococcaceae_NK4A214_group0.77±0.12ABb0.35±0.03Cc1.08±0.24Aa0.49±0.04BCc<0.001埃希氏菌屬-志賀菌屬Escherichia-Shigella0.85±0.16Bb1.46±0.23Aa0.05±0.03Cd0.33±0.01Cc0.001瘤胃球菌屬 Ruminococcus0.20±0.01Bc0.36±0.02Bbc0.97±0.22Aa0.45±0.02Bb<0.001鏈球菌屬 Streptococcus0.88±0.20Aa0.35±0.04Bb0.24±0.04Bb0.30±0.04Bb<0.001寡養(yǎng)單胞菌屬 Stenotrophomonas0.16±0.01Bb1.28±0.21Aa0.04±0.01Bb0.09±0.00Bb0.001p-1088-a5_gut_group0.37±0.120.11±0.030.85±0.850.16±0.130.218狹義梭菌屬1 Clostridium_sensu_stricto_10.12±0.04Bc0.24±0.03ABbc0.34±0.13Aab0.43±0.06Aa0.005鞘氨醇桿菌屬 Sphingobacterium0.00±0.00Bb0.98±0.55Aa0.00±0.00Bb0.00±0.00Bb0.006甲烷短桿菌屬 Methanobrevibacter0.14±0.050.12±0.060.16±0.030.51±0.730.543小梨形菌屬 Pirellula0.11±0.04Bb0.05±0.02Bb0.68±0.39Aa0.08±0.04Bb0.013

圖7 屬水平物種注釋

3 討 論

有研究表明瘤胃微生物可以利用飼糧中的寡糖，添加到飼糧中的寡糖在瘤胃中會(huì)被降解轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性脂肪酸[17]。在MOS降解的過(guò)程中，對(duì)瘤胃發(fā)酵模式會(huì)產(chǎn)生影響而增加丙酸的產(chǎn)量。有研究者比較了基礎(chǔ)飼糧、基礎(chǔ)飼糧+乳寡糖、基礎(chǔ)飼糧+絲蘭植物提取液、基礎(chǔ)飼糧+乳酸鏈球菌肽4種飼糧對(duì)綿羊的影響，結(jié)果表明，各組干物質(zhì)、有機(jī)物、粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的消化率相似，寡糖組微生物氮的供給量最高，乙酸含量最低，丙酸含量最高[18]，說(shuō)明瘤胃微生物可有效降解寡糖，但是由于瘤胃內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性，目前尚不清楚這一系列變化的產(chǎn)生機(jī)理。

3.1 MOS對(duì)灘羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

瘤胃液pH可直觀反映瘤胃內(nèi)環(huán)境是否正常，其過(guò)高或過(guò)低均不利于瘤胃微生物的生長(zhǎng)、增殖[19]。本試驗(yàn)中，4組灘羊瘤胃液pH變動(dòng)范圍為6.45～6.86，在瘤胃液pH的正常范圍(5.5～7.5)內(nèi)[20]。此外，本試驗(yàn)條件下，不同添加水平的MOS對(duì)灘羊瘤胃液pH無(wú)顯著影響，這與張然等[21]的結(jié)果一致，即MOS添加水平在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)體外瘤胃培養(yǎng)液pH沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響，其分析原因可能是MOS添加水平(其最高添加水平為2%)太低。瘤胃液NH3-N含量可在一定程度上反映出瘤胃微生物分解含氮物質(zhì)產(chǎn)生NH3-N及對(duì)其利用的情況。NH3-N含量過(guò)高，會(huì)增加瘤胃氮循環(huán)中氮素的損失，而NH3-N含量過(guò)低，則會(huì)限制纖維素分解菌分解纖維物質(zhì)的效率[22]。本試驗(yàn)中，4組灘羊瘤胃液NH3-N含量在13.33～14.85 mg/dL，在大多研究者認(rèn)可范圍(10～50 mg/dL)之內(nèi)[23]。本試驗(yàn)中，不同添加水平的MOS對(duì)灘羊瘤胃液NH3-N含量無(wú)顯著影響，其中Y2-3組NH3-N含量最高。這可能是因?yàn)?，添?%MOS對(duì)纖維素分解菌分解纖維物質(zhì)的效率的影響比其他組小，從而能保證纖維菌的正常生長(zhǎng)增殖，也可能是2%MOS促進(jìn)了分解含氮微生物的生長(zhǎng)、增殖。瘤胃發(fā)酵類型及揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量主要與飼糧的類型密切相關(guān)[24]，一般而言，粗飼料中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的含量較高，瘤胃中發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸比例較高。本試驗(yàn)中，Y2-3組瘤胃液乙酸含量顯著高于Y3-3組、CK-3組且高于Y1-3組，在同等飼糧條件下，可能的原因是添加2%MOS促進(jìn)了纖維分解菌的增殖，從而促進(jìn)了纖維物質(zhì)的降解。總體而言，添加不同水平MOS均可保證灘羊瘤胃內(nèi)環(huán)境正常。

3.2 MOS對(duì)灘羊瘤胃菌群多樣性的影響

瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性長(zhǎng)期以來(lái)一直是研究的熱點(diǎn)話題[25]。近幾年，16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)被用來(lái)研究反芻動(dòng)物瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)，更利于學(xué)者對(duì)瘤胃細(xì)菌遺傳多樣性的探究[26-27]。本研究基于16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)，探究添加不同水平MOS對(duì)灘羊瘤胃菌群多樣性的影響。通過(guò)質(zhì)控測(cè)序共得888 992個(gè)有效序列用于后續(xù)多樣性組成分析。各組樣本稀釋曲線趨于平緩，表明測(cè)序深度覆蓋了樣本中的大部分微生物，且覆蓋度>0.99，說(shuō)明測(cè)序量和測(cè)序深度合理。Alpha多樣性是對(duì)樣本中物種豐富度和多樣性進(jìn)行分析，主要包括Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)和、Simpson指數(shù)，前2個(gè)指數(shù)可以反映樣品中群落的豐富數(shù)值，該值越大說(shuō)明物種數(shù)量越多，即豐富度越高；后2個(gè)指數(shù)表示群落的多樣性，Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越接近1，表明多樣性越高[28]。本試驗(yàn)中4組灘羊瘤胃菌群Alpha多樣性指數(shù)無(wú)顯著差異，但是總體來(lái)看，添加MOS組的瘤胃菌群多樣性較對(duì)照組有所增加，其中添加2%MOS組對(duì)瘤胃菌群多樣性影響最大，由Beta多樣性分析可知添加2%MOS組的瘤胃菌群構(gòu)成與對(duì)照組相比差異最大。有研究者在錦江黃牛飼糧中添加功能性寡糖組合，結(jié)果表明可提升瘤胃液微生物種類[29]，與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。有研究報(bào)道，MOS添加方式對(duì)哺乳期犢牛瘤胃菌群多樣性未產(chǎn)生顯著影響[30]。有研究表明，低聚糖可通過(guò)改變羔羊斷奶引起的腸道菌群變化及改變微生物的代謝等來(lái)影響動(dòng)物的生產(chǎn)性能[31]。Newman等[32]在犢牛飼糧每天添加2 g MOS，5周后糞便中大腸桿菌數(shù)量明顯降低且呼吸道疾病減少，從而提高生產(chǎn)性能。趙曉靜等[33]在犢牛飼糧中分別添加0.1%和0.2%(干物質(zhì)基礎(chǔ))的MOS，結(jié)果顯示添加0.1%組在降低大腸桿菌和增加乳酸桿菌數(shù)量方面均較不添加組和添加0.2%組優(yōu)勢(shì)明顯。任海軍[34]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.1%殼聚糖顯著增加了奶牛腸道乳酸桿菌數(shù)量且降低了大腸桿菌數(shù)量。以上結(jié)果均說(shuō)明，添加一定水平的MOS可在一定程度上提高灘羊瘤胃菌群的多樣性。

3.3 MOS對(duì)灘羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響

有研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門、厚壁菌門是反芻動(dòng)物纖維物質(zhì)降解的主要菌群，因此瘤胃中擬桿菌門、厚壁菌門豐度的高低與纖維物質(zhì)降解緊密相關(guān)[35-36]。本試驗(yàn)中，變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門為4組中的優(yōu)勢(shì)菌門，與不添加MOS組菌群結(jié)構(gòu)組成相比差異由大到小的添加水平依次為2%、1%、3%，其中添加2%MOS組厚壁菌門、擬桿菌門的相對(duì)豐度最高，說(shuō)明添加2%MOS組灘羊的瘤胃內(nèi)環(huán)境更利于瘤胃細(xì)菌對(duì)蕎麥秸稈等纖維物質(zhì)的降解，在奶牛飼糧中添加MOS同樣發(fā)現(xiàn)能夠改善瘤胃中纖維素降解菌的豐度和活性[37-38]。另有研究表明變形菌門豐度的大量增加是胃腸道菌群失調(diào)的微生態(tài)標(biāo)志[39]。本試驗(yàn)中添加2%MOS組使變形菌門的相對(duì)豐度降低，說(shuō)明在蕎麥秸稈飼糧條件下添加2%MOS可能有利于維持灘羊瘤胃菌群微生態(tài)平衡，具體機(jī)制還有待研究。浮霉菌門是嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陰性細(xì)菌，有研究者為了研究浮霉菌門沿化學(xué)梯度的分布，對(duì)整個(gè)S?lenvannet湖的水柱進(jìn)行了采樣，并使用16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序和454焦磷酸測(cè)序?qū)ξ⑸锶郝溥M(jìn)行了描述，結(jié)果表明與浮霉菌門相關(guān)的16S rDNA基因序列在湖泊的缺氧和氧化部分都存在，并且在整個(gè)水柱中分布不均，在15 m深的鹽堿地缺氧層中其相對(duì)豐度最高，為10%[40]。另外，有研究者在研究黃粉蟲降解腸道塑料廢物的能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，其腸道浮霉菌門可以降解燕麥等纖維類飼料，但是在飼喂聚苯乙烯后浮霉菌門的攝食頻率增加[41]。黏膠球形菌門與纖維二糖的降解有關(guān)，郭威等[42]研究發(fā)酵玉米秸稈對(duì)綿羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，黏膠球形菌門和纖維桿菌門均為綿羊瘤胃中的優(yōu)勢(shì)菌群。本試驗(yàn)中，添加2%MOS組灘羊瘤胃菌群中浮霉菌門、Kiritimatiellaeota和黏膠球形菌門的相對(duì)豐度較其他組高，說(shuō)明添加2%MOS有利于增加與纖維分解有關(guān)的菌，從而促進(jìn)蕎麥秸稈等纖維物質(zhì)的降解。

在屬水平上，本試驗(yàn)中的4組灘羊瘤胃中不同菌群的相對(duì)豐度差異明顯。相比其他組，添加2%MOS對(duì)灘羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)及其相對(duì)豐度影響最大，其中賴氨酸芽孢桿菌屬、普雷沃氏菌屬1、醋桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬且其相對(duì)豐度極顯著大于其他組。普雷沃氏菌屬具有多種功能，它不僅能促進(jìn)最初的蛋白質(zhì)分解并協(xié)同其他分解纖維素菌發(fā)揮作用，提高機(jī)體對(duì)纖維素的分解能力[43]，且對(duì)植物中非纖維性多糖和蛋白質(zhì)的降解也有一定的作用[44]。本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明添加2%MOS可促進(jìn)灘羊瘤胃中普雷沃氏菌的增殖，從而增強(qiáng)對(duì)蕎麥秸稈等相關(guān)纖維物質(zhì)的降解能力。另外，添加2%MOS組灘羊瘤胃菌群中理巖菌科RC9腸道群、解琥珀酸菌屬、瘤胃球菌屬的相對(duì)豐度也極顯著大于其他組。普雷沃氏菌屬1和理巖菌科RC9腸道群都屬于擬桿菌門[45]，所以可推測(cè)理巖菌科RC9腸道群可能是與非纖維植物成分降解有關(guān)的細(xì)菌。瘤胃球菌屬和琥珀酸菌屬均有降解纖維物質(zhì)的能力[46-47]。瘤胃球菌科NK4A214群屬于瘤胃球菌科，有研究表明瘤胃球菌科是一類典型的纖維降解菌[48]，飼糧中性洗滌纖維的消化率隨著瘤胃球菌科豐度的增加而增加[49-50]。也有研究表明瘤胃球菌科可促進(jìn)宿主對(duì)飼糧中氮的消化和利用[51-52]。另外，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加2%MOS組灘羊瘤胃菌群中克里斯滕森菌科R-7群、乳球菌屬、小梨形菌屬的相對(duì)豐度也極顯著大于其他組，這些微生物可能在灘羊瘤胃體內(nèi)扮演著重要的生理及生態(tài)角色。

4 結(jié) 論

① 本試驗(yàn)條件下，飼糧中添加不同水平MOS均可保證灘羊瘤胃內(nèi)環(huán)境正常。

② 本試驗(yàn)條件下，飼糧中添加MOS可增加灘羊瘤胃菌群的多樣性，其中2%MOS對(duì)其影響最大。

③ 本試驗(yàn)條件下，飼糧中添加2%MOS對(duì)灘羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)影響最大，可提高纖維素降解菌的相對(duì)豐度，有利于增強(qiáng)灘羊?qū)︼暭Z纖維物質(zhì)的降解能力。