馮 鑫 欒嘉明 李月明 周金影 金英海 張 敏 耿春銀

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉 2133000)

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)是一類(lèi)可降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的酶，也是調(diào)節(jié)肌肉、脂肪和結(jié)締組織發(fā)育等多種生物學(xué)過(guò)程的重要信號(hào)分子。目前已有25種MMP被鑒定，且每一種MMP都有其特殊的與細(xì)胞外基質(zhì)反應(yīng)的途徑[1]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，MMP2、9、13在肌細(xì)胞、肌纖維及脂肪生成的調(diào)節(jié)中扮演著重要的角色[2]。肌肉纖維數(shù)量及脂肪含量與肌內(nèi)脂肪含量及大理石花紋息息相關(guān)，其不僅可影響肉的嫩度，還會(huì)影響肉的風(fēng)味[3-4]。因此，MMP與肉品質(zhì)的關(guān)系受到研究者的關(guān)注，MMP也有望成為一種新的生物標(biāo)記物用于畜禽肉質(zhì)性狀的遺傳選擇及肉品質(zhì)調(diào)控策略[2]。然而，目前對(duì)MMP的研究大多集中在其活性與人類(lèi)健康和疾病相關(guān)研究上，對(duì)其活性與畜禽肉品質(zhì)相關(guān)關(guān)系的研究較為少見(jiàn)。

MMP的調(diào)節(jié)可發(fā)生在基因表達(dá)水平、酶原激活水平及胞外分泌水平，目前對(duì)MMP的研究絕大部分集中在胞外分泌水平[5]。據(jù)報(bào)道，MMP的分泌不僅受基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMP)的調(diào)控，其還受機(jī)體氧化應(yīng)激的影響[6-7]，而補(bǔ)飼抗氧化劑維生素E及維生素C對(duì)動(dòng)物肉品質(zhì)的改善可能與其對(duì)MMP的影響有關(guān)[8]。在此基礎(chǔ)上，本研究擬揭示肉牛血清MMP2、9、13濃度與血清抗氧化指標(biāo)及肉品質(zhì)指標(biāo)的關(guān)系，為進(jìn)一步通過(guò)MMP調(diào)控肉品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及基礎(chǔ)飼糧

飼養(yǎng)試驗(yàn)在長(zhǎng)春皓月集團(tuán)進(jìn)行。試驗(yàn)動(dòng)物為52頭健康狀況良好、體重相近的雜交育肥公牛[西門(mén)塔爾?！裂舆咟S牛，初始體重(436±35) kg]。試驗(yàn)前對(duì)牛舍進(jìn)行清掃、消毒，提前給牛打好耳號(hào)、驅(qū)蟲(chóng)。試驗(yàn)全期均采用全混合日糧(TMR)飼喂模式，每天飼喂2次(05： 00和17：00)，所有育肥牛栓系飼養(yǎng)，自由采食和飲水，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。試驗(yàn)期每日早晨飼喂后打掃圈舍，定期對(duì)牛舍消毒，飼養(yǎng)145 d后肉牛全部屠宰，測(cè)定屠宰性能及肉品質(zhì)指標(biāo)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 樣本采集及指標(biāo)測(cè)定

1.2.1 血清MMP2、9、13濃度及抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束前1天，在晨飼前用真空采血管采集每頭牛的血液。將采血管在4 ℃的冷凍離心機(jī)中以3 200 r/min的轉(zhuǎn)度離心15 min，分離出的血清用于MMP2、9、13濃度及抗氧化指標(biāo)的測(cè)定。抗氧化指標(biāo)包括總抗氧化能力(T-AOC)，活性氧自由基(ROS)、丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性。MMP2、9、13濃度及上述抗氧化指標(biāo)的測(cè)定方法均為放射免疫法，在北京華英生物技術(shù)研究所完成測(cè)定。

1.2.2 屠宰性能和胴體性狀指標(biāo)的測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束后，所有試驗(yàn)?？崭?2 h后屠宰，記錄宰前活重和熱胴體重，根據(jù)宰前活重和熱胴體重計(jì)算每頭牛的屠宰率。冷藏24 h后進(jìn)行胴體分割，測(cè)定胴體性狀指標(biāo)，包括第12肋骨皮下脂肪厚度(即背膘厚)、第12～13肋骨之間的眼肌面積、大理石花紋評(píng)分及優(yōu)質(zhì)肉塊(眼肉、牛柳和西冷)重，測(cè)定方法參考Geng等[9]。

1.2.3 肉品質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定

牛肉進(jìn)行24 h排酸后，取背最長(zhǎng)肌肉樣(西冷)用于肉品質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定，具體測(cè)定指標(biāo)包括物理指標(biāo)：pH、滴水損失、蒸煮損失、大理石花紋評(píng)分、剪切力及肉色指數(shù)；化學(xué)指標(biāo)：水分、蛋白質(zhì)及肌內(nèi)脂肪含量；脂肪酸組成：飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)、多不飽和脂肪酸(PUFA)、n-3 PUFA、n-6 PUFA比例及營(yíng)養(yǎng)上重要的脂肪酸比值(n-6/n-3、PUFA/SFA、C18∶2n6/C18∶3n3)。其中，pH采用pH測(cè)定儀(Eutech Instruments，pH Spear，美國(guó))測(cè)定，滴水損失、蒸煮損失、大理石花紋評(píng)分、剪切力測(cè)定方法參考Geng等[10]。肉色指數(shù)采用色差儀(Minolta，CR400/410，日本)測(cè)定。水分、蛋白質(zhì)及肌內(nèi)脂肪含量測(cè)定參考AOAC(2000)標(biāo)準(zhǔn)方法。脂肪酸組成采用氣相色譜法測(cè)定，具體過(guò)程參見(jiàn)Geng等[11]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)性描述及相關(guān)分析(皮爾遜相關(guān)分析，雙尾)，P<0.05作為顯著相關(guān)性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉牛血清MMP2、9、13濃度與血清抗氧化指標(biāo)的相關(guān)分析

肉牛血清MMP2、9、13濃度的平均值分別為180.61、187.41、64.74 pg/mL(表2)，其與血清抗氧化指標(biāo)的相關(guān)分析見(jiàn)表3。血清MMP2濃度與血清ROS、MDA含量，GSH-Px、CAT、SOD、GR活性及T-AOC均無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系(P>0.05)；血清MMP9濃度與血清ROS含量顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.358，P=0.011)，與血清其他抗氧化指標(biāo)無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系(P>0.05)；血清MMP13濃度與血清ROS含量顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.292，P=0.040)，與血清其他抗氧化指標(biāo)無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。

表2 肉牛血清MMP2、9、13濃度的數(shù)據(jù)描述

表3 肉牛血清抗氧化指標(biāo)的數(shù)據(jù)描述及其與血清MMP2、9、13濃度的相關(guān)分析

2.2 肉牛血清MMP2、9、13濃度與屠宰性能和胴體性狀指標(biāo)的相關(guān)分析

肉牛屠宰性能和胴體性狀指標(biāo)數(shù)據(jù)描述及其與血清MMP2、9、13濃度的相關(guān)分析見(jiàn)表4。血清MMP2、9、13濃度與屠宰性能指標(biāo)(宰前活重、熱胴體重、屠宰率)均無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。血清MMP2濃度與大理石花紋評(píng)分顯著正相關(guān)(r=0.352，P=0.012)，與包括宰前活重、熱胴體重、屠宰率、眼肌面積、背膘厚、優(yōu)質(zhì)肉塊重在內(nèi)的其他胴體性狀指標(biāo)無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系(P>0.05)；血清MMP9、13濃度與上述胴體性能指標(biāo)均無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。

表4 肉牛屠宰性能和胴體性狀指標(biāo)的數(shù)據(jù)描述及其與血清MMP2、9、13濃度的相關(guān)分析

2.3 肉牛血清MMP2、9、13濃度與肉品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)分析

牛肉物理和化學(xué)指標(biāo)的數(shù)據(jù)描述及其與血清MMP2、9、13濃度的相關(guān)分析見(jiàn)表5。血清MMP2濃度與牛肉肌內(nèi)脂肪含量顯著正相關(guān)(r=0.307，P=0.036)，與包括水分含量、pH、滴水損失、蒸煮損失、剪切力、肉色、蛋白質(zhì)含量、肌內(nèi)脂肪含量在內(nèi)的其他牛肉物理和化學(xué)指標(biāo)無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系(P>0.05)；血清MMP9濃度與牛肉剪切力顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.430，P=0.002)，與其他牛肉物理和化學(xué)指標(biāo)無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系(P>0.05)；血清MMP13濃度與牛肉剪切力顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.281，P=0.048)，與其他牛肉物理和化學(xué)指標(biāo)無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。

表5 牛肉物理和化學(xué)指標(biāo)的數(shù)據(jù)描述及其與血清MMP2、9、13濃度的相關(guān)分析

牛肉脂肪酸組成及營(yíng)養(yǎng)上重要的脂肪酸比值的數(shù)據(jù)描述及其與血清MMP2、9、13濃度的相關(guān)分析見(jiàn)表6。血清MMP2、9、13濃度與牛肉SFA、MUFA、PUFA、n-3 PUFA、n-6 PUFA比例以及營(yíng)養(yǎng)上重要的脂肪酸比值n-6/n-3、PUFA/SFA、C18∶2n6/C18∶3n3均無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。

表6 牛肉脂肪酸組成及營(yíng)養(yǎng)上重要的脂肪酸比值的數(shù)據(jù)描述及其與血清MMP2、9、13濃度的相關(guān)分析

3 討 論

ROS是機(jī)體正常代謝的產(chǎn)物之一，機(jī)體可以通過(guò)自身產(chǎn)生的抗氧化物質(zhì)清除ROS，但是當(dāng)機(jī)體抗氧化能力不足時(shí)，就會(huì)引起氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致ROS含量增加，進(jìn)而影響MMP的活性[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，肉牛血清MMP9、13濃度與血清ROS含量顯著負(fù)相關(guān)，這與上述報(bào)道結(jié)論相符，說(shuō)明ROS可以影響MMP9、13的活性。

機(jī)體內(nèi)的MMP可以促進(jìn)肌肉中膠原蛋白的生成，加速結(jié)締組織周轉(zhuǎn)，有利于肌肉嫩度的改善[6]。給反芻動(dòng)物補(bǔ)飼抗氧化劑如維生素E和維生素C可以明顯改善肉的嫩度[12-13]，這可能與其對(duì)ROS的清除，進(jìn)而保護(hù)MMP9、13的活性有關(guān)。酵母制劑可以改善牛肉的嫩度[10]，其對(duì)嫩度的改善可能就是通過(guò)改善抗氧化能力影響MMP途徑實(shí)現(xiàn)的[14]。

一些血液指標(biāo)可作為生物標(biāo)記物，進(jìn)行胴體、肉品質(zhì)及消化率等性狀的遺傳篩選[9，11，15]，這也是加速現(xiàn)代動(dòng)物育種進(jìn)程的一種重要方法。MMP是與動(dòng)物肉品質(zhì)密切相關(guān)的遺傳基因，其種類(lèi)多、功能強(qiáng)大，與加速肌肉中結(jié)締組織周轉(zhuǎn)、促進(jìn)肌肉脂肪沉積等功能息息相關(guān)，有望成為一種新的生物標(biāo)記物用于畜禽肉質(zhì)性狀的遺傳選擇及肉品質(zhì)調(diào)控[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，肉牛血清MMP2濃度與牛肉大理石花紋評(píng)分及肌內(nèi)脂肪含量顯著正相關(guān)，血清MMP9、13濃度與牛肉剪切力顯著負(fù)相關(guān)，這表明血清MMP2、9、13可作為一種新的生物標(biāo)記物用于肉牛肉質(zhì)相關(guān)性狀的遺傳篩選或是肉品質(zhì)調(diào)控策略。

祁艷霞等[16]和Qi等[17]從基因表達(dá)水平探討了MMP1、2、8、13基因的表達(dá)量與雜交肉牛(南陽(yáng)牛與夏洛萊的F1代)肉品質(zhì)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)MMP1、2基因的表達(dá)量與剪切力顯著負(fù)相關(guān)，MMP13基因的表達(dá)量與系水力顯著負(fù)相關(guān)，MMP8基因的表達(dá)量與肉品質(zhì)指標(biāo)無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系。據(jù)報(bào)道，MMP的表達(dá)及分泌不僅存在種類(lèi)差異，還與遺傳、組織部位及環(huán)境等因素有關(guān)[2]，這可能是導(dǎo)致結(jié)果差異的主要原因。

擴(kuò)充在特定條件下(如肉牛品種、飼糧等因素)MMP與肉牛肉質(zhì)性狀關(guān)系的資料，是對(duì)其科學(xué)應(yīng)用的重要前提。從應(yīng)用角度，未來(lái)應(yīng)加強(qiáng)在特定條件下不同種類(lèi)的MMP及其抑制劑TIMP與肉牛肉質(zhì)性狀的相關(guān)研究，同時(shí)應(yīng)從遺傳角度深入探討MMP基因多態(tài)性與肉品質(zhì)的關(guān)系，為其進(jìn)一步應(yīng)用與實(shí)踐奠定理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

綜上可知，肉牛血清MMP2濃度與牛肉大理石花紋評(píng)分顯著正相關(guān)，血清MMP9、13濃度與血清ROS含量及牛肉剪切力顯著負(fù)相關(guān)，血清MMP2、9、13濃度可成為潛在的生物標(biāo)記物用于肉牛肉質(zhì)性狀的遺傳選擇或肉品質(zhì)調(diào)控策略。