鐘 銳 李蔭柱 劉 博 牛文智 張桂杰*

(1.寧夏大學(xué)動(dòng)物科學(xué)系，銀川 2750021；2.吳忠市紅寺堡區(qū)天源良種羊繁育養(yǎng)殖有限公司，吳忠 2751900)

反芻動(dòng)物脂肪組織形成主要發(fā)生在胚胎期[1]。脂肪沉積包括脂肪細(xì)胞增殖和肥大，脂肪細(xì)胞增殖主要通過妊娠中后期肌內(nèi)脂肪發(fā)育開始時(shí)增加脂肪沉積位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)，而脂肪細(xì)胞肥大主要通過育肥階段營養(yǎng)供應(yīng)實(shí)現(xiàn)[2]。妊娠期母體營養(yǎng)水平與胚胎發(fā)育及其血管生成密切相關(guān)，因此妊娠中后期母體營養(yǎng)供給模式可改變胎兒脂肪發(fā)育與沉積[3-5]，直接影響到成年子代胴體品質(zhì)和肉品質(zhì)。隨著動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)研究的深入，業(yè)內(nèi)人士越來越重視功能性氨基酸在動(dòng)物生產(chǎn)及營養(yǎng)調(diào)控方面的作用。氮氨甲酰谷氨酸(N-carbamyl glutamate，NCG)能有效激活內(nèi)源性精氨酸(arginine，Arg)合成途徑中關(guān)鍵酶——氨甲酰磷酸合成酶-Ⅰ(carbamoyl phosphate synthase-Ⅰ，CPS-Ⅰ)，啟動(dòng)內(nèi)源性Arg合成[6-9]，Arg直接參與動(dòng)物體內(nèi)多胺和一氧化氮(NO)形成。血液中NO含量升高有助于血管擴(kuò)張和血液流動(dòng)，可增強(qiáng)胚胎與母體之間的聯(lián)系，與胚胎期的脂肪發(fā)育啟動(dòng)密切相關(guān)。與Arg相比，NCG性質(zhì)穩(wěn)定、半衰期長，可提高母體胎盤的最外層及滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)及活性，促進(jìn)離子、糖、水及氨基酸進(jìn)入胎兒，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)利用率并改善胎盤發(fā)育[10]。研究表明，在豬飼糧中添加適量的NCG可顯著提升胚胎存活率，上調(diào)與胚胎著床相關(guān)因子的表達(dá)，并誘導(dǎo)胚胎和胎兒發(fā)育[11-12]。

本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加0.10% NCG可以顯著提高灘羊肌內(nèi)脂肪含量，改善育肥期灘羊的體脂分配，顯著提高肉品質(zhì)[13-14]。但關(guān)于家畜妊娠階段飼糧添加NCG是否調(diào)控新生子代生長發(fā)育和脂肪沉積，尚缺乏理論支持。因此，本試驗(yàn)旨在探討妊娠中后期母體供給NCG對(duì)新生子代灘羊生長發(fā)育、不同部位脂肪沉積相關(guān)基因表達(dá)與母體血清生化指標(biāo)的影響，以期為NCG調(diào)控母子一體化高效生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼糧

試驗(yàn)選用胎次、年齡和體重[(47.75±1.20) kg]相近的經(jīng)產(chǎn)灘母羊80只，采用同期發(fā)情后進(jìn)行人工授精配種，成功受孕63只。選擇成功受孕的60只母羊進(jìn)行試驗(yàn)。妊娠70 d按母羊體重隨機(jī)分為2組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6只羊。分娩結(jié)束時(shí)，每只妊娠母羊均產(chǎn)羔羊1只，共計(jì)60只。

試驗(yàn)基礎(chǔ)飼糧參考NRC(2007)設(shè)計(jì)，其組成及營養(yǎng)水平見表1，對(duì)照組母羊飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼糧中添加0.10% NCG(NCG含量≥95%，水分含量≤3%，總砷含量≤5 mg/kg，鉛含量≤10 mg/kg)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)羊打耳號(hào)后飼養(yǎng)在通風(fēng)良好的半開放式羊舍內(nèi)，妊娠前期統(tǒng)一進(jìn)行飼喂，妊娠中后期進(jìn)行分群飼喂。預(yù)試期7 d，正試期至分娩結(jié)束。每天08：00和16：00分2次飼喂，自由飲水。按羊場操作程序進(jìn)行消毒、驅(qū)蟲和免疫。每天根據(jù)飼糧剩余量調(diào)整飼喂量，保證飼糧剩余量<5%，直至分娩結(jié)束。

1.3 樣品采集與處理

每個(gè)組中隨機(jī)挑選母羊5只，共計(jì)10只，妊娠結(jié)束后，立即將新生羔羊進(jìn)行屠宰，擦干新生羔羊體外胎液后測定初生重及體尺指標(biāo)。母羊分娩后靜脈采血5 mL，收集血清，置于-20 ℃冰箱保存，待測。分別采集新生羔羊腎周脂肪(腎脂)、腸系膜脂肪(腸脂)、腹部皮下脂肪(皮脂)和尾部脂肪(尾脂)約10 g，因母羊妊娠結(jié)束時(shí)間并不統(tǒng)一，為防止樣品RNA降解，樣品置于液氮中保存，備用。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 新生子代灘羊的初生重與體尺

測定所有新生子代灘羊的初生重和體尺。

初生重：擦干新生羔羊體外胎液后稱重。

體高：肩胛骨最高點(diǎn)到地面的垂直距離。

體長：肩端至坐骨結(jié)節(jié)末端距離。

胸深：鬐甲至胸骨下緣的垂直距離。

胸圍：肩胛骨后緣繞胸1周的長度。

1.4.2 母羊血清生化指標(biāo)

所選10只母羊妊娠結(jié)束后，靜脈采血5 mL，置于離心管中，1 980×g、4 ℃離心15 min，收集血清，置于-20 ℃冰箱保存。采用全自動(dòng)生化分析儀(TBA-40FR，日本東芝公司)，通過比色法測定血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、總膽固醇(CHO)、葡萄糖(GLU)、尿素氮(UN)含量，試劑盒購自南京建成生物工程研究所，按照說明書要求進(jìn)行操作。

1.4.3 新生子代灘羊不同部位脂肪組織中脂肪沉積相關(guān)基因表達(dá)

采用TRIzol法提取新生子代灘羊腎脂、腸脂、皮脂和尾脂的總RNA，取少量RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。參照TIAN Script RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作獲得cDNA，并以此為模板，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測定脂蛋白脂酶(LPL)、脂肪酸合成酶(FAS)、硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)mRNA相對(duì)表達(dá)水平。引物采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，PCR引物序列見表2。以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參，在ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。根據(jù)目的基因和β-actin的閾值循環(huán)(Ct)，采用2-△△Ct法計(jì)算樣品中各脂肪沉積相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平[15]。

表2 PCR引物序列

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010軟件進(jìn)行初步整理計(jì)算，采用SAS 8.2 TTEST過程統(tǒng)計(jì)分析，組間差異利用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P<0.05表示差異顯著，0.05≤P<0.10表示有顯著趨勢。

2 結(jié) 果

2.1 NCG對(duì)新生子代灘羊初生重及體尺的影響

由表3可見，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組新生子代灘羊初生重顯著上升了6.1%(P<0.05)，體長和體高有上升趨勢(0.05≤P<0.10)，胸圍和胸深無顯著差異(P>0.05)。

表3 NCG對(duì)新生子代灘羊初生重及體尺的影響

2.2 NCG對(duì)新生子代灘羊不同部位脂肪組織中脂肪沉積相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

由表4可見，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組新生子代灘羊腎脂中LPLmRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著提高了18.6%(P<0.05)，而腎脂中GLUT4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著下降了13.3%(P<0.05)；試驗(yàn)組新生子代灘羊腸脂中LPLmRNA相對(duì)表達(dá)水平有降低趨勢(0.05≤P<0.10)；新生子代灘羊腸脂、腎脂和尾脂中SCDmRNA相對(duì)表達(dá)水平有上升趨勢(0.05≤P<0.10)，皮脂中SCDmRNA相對(duì)表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)；新生子代灘羊腸脂、腎脂、皮脂和尾脂中FASmRNA相對(duì)表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)。

表4 NCG對(duì)新生子代灘羊不同部位脂肪組織中脂肪沉積相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

2.3 妊娠前、后母羊體重和日采食量

由表5可見，對(duì)照組與試驗(yàn)組妊娠前、后母羊體重和日采食量均無顯著差異(P>0.05)。

表5 妊娠前、后母羊體重和日采食量

2.4 NCG對(duì)妊娠母羊血清生化指標(biāo)的影響

由表6可見，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組母羊血清TP和GLB含量有上升趨勢(0.05≤P<0.10)，血清CHO、GLU和UN含量有下降趨勢(0.05≤P<0.10)。

表6 NCG對(duì)妊娠母羊血清生化指標(biāo)的影響

3 討 論

3.1 NCG對(duì)新生子代灘羊初生重及體尺的影響

動(dòng)物出生體重及體尺是反映其生長發(fā)育狀況的重要指標(biāo)[10，13]。胎兒發(fā)育依靠血液從母體內(nèi)獲得大量營養(yǎng)物質(zhì)來滿足自身需要，母體營養(yǎng)不良會(huì)導(dǎo)致胎兒生長發(fā)育受阻[16]。因此妊娠期母羊的營養(yǎng)調(diào)控至關(guān)重要。NCG能激活CPS-Ⅰ及二氫吡咯-5羧酸合成酶(P5CS)，從而促進(jìn)內(nèi)源性Arg的合成。Arg是動(dòng)物生產(chǎn)中條件性必需氨基酸且積極參與胚胎、胎盤及胎兒的生長發(fā)育[6，17-18]。大量研究表明，在妊娠母豬飼糧中添加不同水平NCG或Arg在改善母豬繁殖性能的同時(shí)可以提高窩產(chǎn)活仔數(shù)和初生窩重，保證胎兒的存活、生長和發(fā)育[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，NCG顯著提高了新生子代灘羊的初生重，而且體高和體長均有上升趨勢，可能是飼糧中添加NCG提高母體血液和子宮液中Arg濃度，進(jìn)而促進(jìn)胎盤NO和多胺的合成[10，21]。NO含量增加可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的產(chǎn)生，誘導(dǎo)血管舒張并促進(jìn)血流速度，多胺刺激血管生成、胚胎發(fā)育和胎盤生長，提高胎盤對(duì)胎兒營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)[22-23]。此外，NCG的補(bǔ)充還可影響VEGF中miR-15b、miR-222和臍靜脈內(nèi)皮表面一氧化氮合酶(NOS)基因的表達(dá)，從而改善臍靜脈功能和容積，使胎兒從母體獲得更多的營養(yǎng)和氧氣[22-25]，進(jìn)而改善胎兒生長發(fā)育。

3.2 NCG對(duì)新生子代灘羊不同部位脂肪組織中脂肪沉積相關(guān)基因表達(dá)的影響

脂肪的合成主要有2種方式，其一為小腸黏膜細(xì)胞由甘油單酸酯與脂肪酸合成脂肪，其二為肝細(xì)胞與脂肪細(xì)胞由甘油二酸酯合成脂肪，然后通過血液循環(huán)運(yùn)輸?shù)郊∪獾炔煌M織中沉積[26]。體脂的沉積是動(dòng)物貯存能量的主要方式，其沉積量取決于脂肪合成代謝與分解代謝速度的高低[27]。反芻動(dòng)物脂肪組織的形成多發(fā)生在妊娠中后期[4]，而腸脂、腎脂、皮脂和尾脂組織過度發(fā)育會(huì)導(dǎo)致脂肪過度累積，影響灘羊的胴體品質(zhì)。探究與脂肪沉積相關(guān)的候選基因和分子機(jī)制已成為脂肪沉積研究中的熱點(diǎn)內(nèi)容，不增加或降低無效脂肪的形成并增加脂肪內(nèi)風(fēng)味物質(zhì)的沉積，才能改善胴體品質(zhì)[28]。研究表明，LPL、FAS、SCD和GLUT4等在脂肪代謝調(diào)節(jié)過程中起著關(guān)鍵作用[29-31]。

LPL是脂質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵酶，主要在脂肪組織、心臟肌肉和巨噬細(xì)胞中表達(dá)[32-33]，其活性的高低反映脂肪的蓄積程度，對(duì)組織的脂肪的沉積起負(fù)向調(diào)控作用。LPL能夠使動(dòng)物機(jī)體內(nèi)甘油三酯降解為甘油和游離脂肪酸，以供機(jī)體組織儲(chǔ)存和利用。LPL可調(diào)節(jié)肌肉和脂肪甘油三酯的分配，是決定脂肪細(xì)胞大小的重要因素。LPL基因也通過調(diào)節(jié)不同組織內(nèi)脂蛋白的沉積而影響胴體品質(zhì)[34]。本研究中，LPLmRNA相對(duì)表達(dá)水平在腎脂中顯著上升，抑制腎周脂囤積，與Bonnet等[35]研究結(jié)果相一致。這說明妊娠中后期灘羊母羊飼糧中添加NCG能夠影響新生子代羔羊LPL的表達(dá)，可調(diào)控羔羊的脂肪分配，對(duì)提高新生子代灘羊的胴體品質(zhì)有積極作用。

FAS是合成動(dòng)物內(nèi)源性脂肪酸和脂質(zhì)積累的關(guān)鍵酶，在靶組織中參與脂質(zhì)代謝，可改變脂肪酸生物合成速率。主要分布于高脂肪代謝和對(duì)激素敏感的組織中，可催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A用以長鏈脂肪酸的合成[36-37]。因此，F(xiàn)AS表達(dá)可調(diào)控脂肪酸合成速度，其活性與胴體脂肪含量呈正相關(guān)[34]。本研究中，NCG沒有提高新生子代灘羊腸脂、腎脂、皮脂和尾脂中FASmRNA相對(duì)表達(dá)水平。這說明妊娠中后期灘羊母羊飼糧中添加NCG沒有增加新生子代灘羊腸脂、腎脂、皮脂和尾脂長鏈脂肪酸合成量，對(duì)腸脂、腎脂、皮脂和尾脂中脂質(zhì)積累物無影響，新生子代灘羊的胴體品質(zhì)未受影響。

SCD是一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的跨膜蛋白，是合成單不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶，可在脂肪酸C9位置引入不飽和雙鍵，將飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化成不飽和脂肪酸[38]，影響著羊肉大理石花紋，脂肪柔軟度及羊肉內(nèi)風(fēng)味物質(zhì)的沉積等[36]。在哺乳動(dòng)物中，SCD主要在肝臟、脂肪等脂肪生成的組織中表達(dá)，其次在腎臟、肺臟等組織中表達(dá)，其對(duì)肝臟脂肪的沉積起著重要作用[38]。本研究結(jié)果表明，NCG可提高新生子代灘羊腸脂、腎脂和尾脂中SCDmRNA相對(duì)表達(dá)水平。這說明妊娠中后期灘羊母羊飼糧中添加NCG會(huì)誘導(dǎo)子代灘羊SCD的表達(dá)。

GLUT4在哺乳動(dòng)物GLU跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起重要作用，對(duì)調(diào)節(jié)能量平衡和調(diào)控脂肪沉積作用顯著[39]。GLUT4作為胰島素中介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因子，主要分布在脂肪組織細(xì)胞，這些細(xì)胞在胰島素刺激下GLU攝入量迅速升高，其表達(dá)不足會(huì)使胰島素敏感性降低，導(dǎo)致對(duì)GLU的利用減少[28，35，40]。本研究通過對(duì)灘羊GLUT4在不同脂肪組織中mRNA表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，NCG使新生子代灘羊腎脂GLUT4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著下降，可能是妊娠中后期灘羊母羊飼糧中添加NCG可降低子代灘羊腎臟周圍脂肪組織細(xì)胞對(duì)GLU的吸收利用，進(jìn)而抑制子代灘羊腎臟周圍脂肪的生成，對(duì)改善羔羊體況發(fā)育起積極作用。

3.3 NCG對(duì)母羊血清生化指標(biāo)的影響

血清生化指標(biāo)是反映動(dòng)物機(jī)體免疫功能、酶活性及臟器功能完整性的重要指標(biāo)[41]。血清TP含量的高低反映了蛋白質(zhì)的代謝水平，TP含量變高，有利于促進(jìn)動(dòng)物生長，提高飼料轉(zhuǎn)化效率。血清UN含量是衡量機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝和氨基酸平衡的重要指標(biāo)，蛋白質(zhì)代謝良好則血清UN含量降低，相反飼糧中1種或多種氨基酸缺乏或過量時(shí)會(huì)造成血清UN含量的上升[42-43]。研究表明，瘤胃上皮細(xì)胞和十二指腸細(xì)胞具有利用NCG進(jìn)行尿素再循環(huán)的能力[44]，此外，飼糧中添加NCG能有效降低哺乳仔豬及斷奶仔豬血清UN含量[45]。山羊羔羊灌服適量NCG可提高血清TP、ALB和Arg含量[9]。Arg可提高泌乳奶牛對(duì)蛋白質(zhì)的利用，增加血清TP含量[10]。GLU是動(dòng)物機(jī)體糖代謝平衡的重要指標(biāo)，GLU含量的恒定可優(yōu)先滿足大腦、胎兒和泌乳等需求。GLU含量的動(dòng)態(tài)平衡是依靠GLU來源和去路的協(xié)調(diào)來維持，動(dòng)物在采食消化吸收期間，由腸道吸收大量GLU，其去路主要為各種組織中分解供能或轉(zhuǎn)變?yōu)橹緝?chǔ)存[46]，此外，母畜妊娠胎兒時(shí)必須利用GLU，泌乳時(shí)需大量的GLU合成乳糖[47]。本研究中，妊娠中后期灘羊母羊飼糧中添加NCG后，妊娠母羊血清TP含量增高，血清UN、GLU含量降低，且均處于正常范圍內(nèi)，可能是由于妊娠期母羊飼糧添加NCG促進(jìn)母羊體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成效率，同時(shí)激活CPS-Ⅰ將體內(nèi)多余的氨化為尿素，并提供更多GLU滿足胎兒和泌乳需求。

4 結(jié) 論

妊娠中后期灘母羊飼糧中添加0.10% NCG可提高新生子代羔羊初生重，改善生長發(fā)育，調(diào)控脂肪沉積相關(guān)基因LPL、SCD和GLUT4的表達(dá)。