王偉佳,劉愛國*,廖振宇,劉立增,孫麗婷,楊紅,劉蕊,劉長旭,李雨軒

1(天津商業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室,天津,300134)2(譜尼測試科技(天津)有限公司,天津,300392)

苯甲酸(benzoic acid)又叫安息香酸,常常在食品中作為防腐劑使用[1]。GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[2]中規(guī)定了其在各類食品中允許使用的限量要求,如在食品中超范圍或超限量使用會對人體肝臟產(chǎn)生危害,甚至致癌。但在日常檢驗過程中發(fā)現(xiàn)，部分食品中天然存在苯甲酸,因此,內(nèi)源性的苯甲酸為食品的日常監(jiān)管檢驗產(chǎn)生一定的困擾。孫屏等[3]研究發(fā)現(xiàn)，新疆紅棗中天然苯甲酸平均值為84 mg/kg；張青云等[4]報道了蜂蜜中含有不超過15 mg/kg的苯甲酸；SIEBER等[5]的研究發(fā)酵乳的苯甲酸含量能達(dá)到50 mg/kg。一般來說,內(nèi)源性苯甲酸產(chǎn)生有以下3種途徑[6-8]:馬尿酸水解、苯丙氨酸代謝、苯甲醛氧化。國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定發(fā)酵乳中不允許使用苯甲酸[2],但在實際檢測中,由于原料乳在乳酸菌的作用下,馬尿酸脫甘氨酸產(chǎn)生苯甲酸[9],因而發(fā)酵乳中經(jīng)常被檢出苯甲酸天然殘留。隨著消費(fèi)者越來越關(guān)心飲食安全,為降低發(fā)酵乳中內(nèi)源性苯甲酸的含量,保障百姓尤其兒童身體健康[10],本論文通過研究不同濃度的全脂乳粉、發(fā)酵溫度、時間、pH、乳酸菌種類對發(fā)酵乳中苯甲酸產(chǎn)生的影響,初步探究發(fā)酵乳中苯甲酸產(chǎn)生的規(guī)律,為乳品質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料

全脂乳粉,新西蘭恒天然集團(tuán)；白砂糖,廣西上上糖業(yè)有限公司；嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌,普爾斯(天津)國際貿(mào)易有限公司；發(fā)酵乳,超市。

馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)品、苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品,中國計量科學(xué)研究院；甲醇(色譜純),美國Hipure Chem 公司；乙酸鋅(分析純),天津市福晨化學(xué)試劑廠；亞鐵氰化鉀(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、硫酸(優(yōu)級純)、冰乙酸(分析純),天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；乳酸(分析純),北京純奇商貿(mào)有限責(zé)任公司；碳酸氫鈉(分析純),天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.1.2 儀器設(shè)備

Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀、CNW C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),日本Shimadzu公司；WTL-4K離心機(jī),湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；KQ-800DE超聲儀,昆山市超聲儀器有限公司；PHS-3C型pH計,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵乳的制備

水預(yù)熱(50 ℃)→復(fù)原乳[10%全脂乳粉，6%白砂糖，均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)(下同)]→殺菌(85 ℃,20 min)→冷卻降溫(40 ℃)→接入發(fā)酵劑(0.04%嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌混合發(fā)酵劑)→攪拌(10 min)→ 保溫發(fā)酵(42 ℃,5 h)→冷藏保存(4 ℃)[11]

1.2.2 樣品前處理

稱取 20 g 樣品(精確至 0.01 g)于100 mL 容量瓶中,加入 25 mL 0.1 mol/L NaOH溶液,混合后置于超聲波水浴或 70 ℃水浴中處理15 min。冷卻后,用 0.5 mol/L H2SO4溶液調(diào)pH到8,分別加入 2 mL 92 g/L亞鐵氰化鉀溶液和183 g/L 乙酸鋅溶液。劇烈振搖,靜置 15 min,混合后冷卻到室溫,甲醇定容,靜置 15 min,4 000 r/min 離心,上清液經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾。收集濾液,用于高效液相色譜儀測定樣品中馬尿酸和苯甲酸含量[12]。

1.2.3 全脂乳粉添加量的確定

分別以6%、8%、10%、12%、14%的全脂乳粉添加量進(jìn)行發(fā)酵乳制作。

1.2.4 發(fā)酵初始酸度確定

按照1.2.1小節(jié)的方法進(jìn)行發(fā)酵乳制備,在發(fā)酵前分別用乳酸調(diào)節(jié)復(fù)原乳pH至3、4、5和6,用碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7,然后進(jìn)行發(fā)酵。

1.2.5 發(fā)酵溫度確定

按照1.2.1小節(jié)的方法制備發(fā)酵乳,分別控制發(fā)酵溫度為25、35、42、45和50 ℃。

1.2.6 發(fā)酵時間控制

按照1.2.1小節(jié)制備發(fā)酵乳,每隔1 h進(jìn)行發(fā)酵乳的采集,直至發(fā)酵6 h。

1.2.7 乳酸菌種類控制

按照1.2.1小節(jié)制備發(fā)酵乳,改變發(fā)酵劑類型,分別以嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌作為發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵。

1.2.8 色譜條件

高效液相色譜柱溫箱柱溫為40 ℃,進(jìn)樣量10 μL,以0.4%乙酸和甲醇為流動相,流速1 μL/mL,進(jìn)行等度洗脫,檢測波長為240 nm。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

全部數(shù)據(jù)用SPSS 23.0分析,采用Origin 9.5 以及Office 2019繪制圖表。

2 結(jié)果與討論

2.1 苯甲酸與馬尿酸HPLC方法驗證

2.1.1 線性范圍、線性方程以及檢出限

配制質(zhì)量濃度為0、0.1、0.5、1、5、10、20 μg/mL的馬尿酸和苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,上機(jī)檢測,10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖如圖1所示。結(jié)果表明,在0～20 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)有著比較好的線性關(guān)系,馬尿酸和苯甲酸的相關(guān)系數(shù)分別為0.999 8和0.999 7,線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限[13](3 S/N)、定量限[13](10 S/N)如表1所示。發(fā)酵乳樣品色譜圖見圖2。由實驗結(jié)果可知該方法對馬尿酸和苯甲酸有著較高的分離度,且靈敏度好。

表1 馬尿酸與苯甲酸檢測的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 1 Linear equation,linear range,correlation coefficient,detection limit and quantification limit for hippuric acid and benzoic acid

圖1 不同濃度馬尿酸、苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatograms of different concentrations of hippuric acid and benzoic acid standards

圖2 發(fā)酵乳樣品液相色譜圖Fig.2 Liquid chromatogram of fermented milk sample

2.1.2 回收率和精密度

取發(fā)酵乳樣品,分別對其做1、5和10 μg/mL的加標(biāo)回收實驗(表2),樣品按照1.2.2和1.2.3小節(jié)的方法進(jìn)行處理。馬尿酸和苯甲酸的回收率分別為97.46%、98.67%。

表2 發(fā)酵乳樣品馬尿酸與苯甲酸的回收率Table 2 Recovery of hippuric acid and benzoic acid in fermented milk

選取一個發(fā)酵乳樣品,進(jìn)行7次平行實驗,測定相應(yīng)的峰面積(表3)。結(jié)果表明,馬尿酸與苯甲酸的RSD分別為0.405%和1.298%,均小于15%,該方法有較好的重復(fù)性和準(zhǔn)確性[14]。

表3 發(fā)酵乳樣品馬尿酸與苯甲酸的精密度測定Table 3 Repeatability analysis of hippuric acid and benzoic acid in yogurt

2.2 發(fā)酵乳中苯甲酸產(chǎn)生的影響因素

2.2.1 全脂乳粉含量的影響

分別添加6%、8%、10%、12%、14%的全脂乳粉,0.02%嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌混合發(fā)酵劑,發(fā)酵溫度40 ℃,發(fā)酵6 h制備發(fā)酵乳。測定發(fā)酵完成的樣品中馬尿酸和苯甲酸含量,結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同全脂乳粉濃度發(fā)酵乳中馬尿酸和苯甲酸含量Fig.3 Contents of hippuric acid and benzoic acid in fermented milk with different whole milk powder concentration

隨著乳粉含量的增加,發(fā)酵乳中馬尿酸的含量也相應(yīng)提高。全脂乳粉在6%～14%的范圍內(nèi),發(fā)酵前發(fā)酵乳中馬尿酸含量為23.732～55.667 μg/mL,發(fā)酵后馬尿酸含量明顯降低,其范圍在20.402～35.997 μg/mL;苯甲酸在全脂乳粉含量為14%的發(fā)酵乳中含量最高,為(12.078±0.135)μg/mL。結(jié)果表明發(fā)酵乳中苯甲酸的含量與原料乳中馬尿酸水平呈正相關(guān)。

2.2.2 發(fā)酵初始酸度的影響

發(fā)酵乳發(fā)酵前加入乳酸調(diào)節(jié)pH(3～7),觀察初始pH對發(fā)酵乳中苯甲酸產(chǎn)生的影響。發(fā)酵條件與1.2.1小節(jié)一致,實驗結(jié)果如圖4所示。在發(fā)酵過程中,當(dāng)初始pH<6時,隨著pH值的升高,苯甲酸的含量逐漸遞增,同時,馬尿酸的含量逐步降低。當(dāng)pH值>6時,發(fā)酵乳中苯甲酸含量呈下降趨勢。乳酸菌最適生長pH為5.5～6.5[15-17],當(dāng)初始pH<4時,樣品中馬尿酸轉(zhuǎn)化成苯甲酸的能力較弱,苯甲酸含量較低。

圖4 不同pH對發(fā)酵乳中馬尿酸和苯甲酸的影響Fig.4 Effects of different pH on hippuric acid and benzoic acid in fermented milk

2.2.3 發(fā)酵溫度的影響

觀察在25、35、40、45、50 ℃下發(fā)酵乳中馬尿酸和苯甲酸的變化規(guī)律。40 ℃下,苯甲酸含量達(dá)到最高值,為(10.448±0.576)μg/mL。高于40 ℃時,苯甲酸含量隨著發(fā)酵溫度的升高,呈下降趨勢(圖5)。

圖5 發(fā)酵溫度對發(fā)酵乳中馬尿酸和苯甲酸的影響Fig.5 Effects of temperature on hippuric acid and benzoic acid in fermented milk

文獻(xiàn)表明苯甲酸產(chǎn)生的最佳溫度分別為40 ℃以及38.12 ℃[18-19],與本實驗結(jié)果較為一致。當(dāng)發(fā)酵溫度為40 ℃時,乳酸菌處于最佳的代謝溫度,代謝強(qiáng)度也達(dá)到較高的水平,從而促進(jìn)了馬尿酸的水解,產(chǎn)生更多的苯甲酸。

2.2.4 發(fā)酵時間的影響

在發(fā)酵過程中,每隔1 h取1次樣品,進(jìn)行發(fā)酵乳中馬尿酸和苯甲酸檢測,觀察在發(fā)酵過程中馬尿酸和苯甲酸的轉(zhuǎn)化規(guī)律。隨著發(fā)酵時間的延長,苯甲酸含量呈現(xiàn)上升趨勢,馬尿酸含量與之相反,且在2～4 h內(nèi)苯甲酸含量增加較快(圖6),之后趨于平緩。SIGITA等[20]報道乳酸菌處于生長對數(shù)期時,馬尿酸轉(zhuǎn)化苯甲酸的速度較快。

圖6 發(fā)酵過程中苯馬尿酸和苯甲酸的變化Fig.6 Changes of benzoic acid and benzoic acid during fermentation

2.2.5 乳酸菌種類的影響

以不同的乳酸菌作為發(fā)酵劑制備發(fā)酵乳,比較不同菌種之間產(chǎn)生苯甲酸的差異。在選取的5種發(fā)酵劑中雙歧桿菌產(chǎn)生的苯甲酸含量最低(0.238 μg/mL),以鼠李糖乳桿菌作為發(fā)酵劑的樣品中苯甲酸含量最高(10.355 μg/mL)。作為發(fā)酵乳中常用的保加利亞乳桿菌,也產(chǎn)生較高濃度的苯甲酸(圖7)。

圖7 發(fā)酵乳中不同發(fā)酵劑對苯甲酸含量的影響Fig.7 Effects of different starter on benzoic acid content in fermented milk

在YU等[19]的研究中,當(dāng)發(fā)酵24 h時,鼠李糖乳桿菌發(fā)酵的發(fā)酵乳苯甲酸含量為13.89 μg/mL,由雙歧桿菌產(chǎn)生的苯甲酸為1.43 μg/mL。實驗結(jié)果表明,發(fā)酵乳中苯甲酸的產(chǎn)生受到發(fā)酵劑類型的影響。

2.3 市售發(fā)酵乳中苯甲酸含量的檢測

從超市購買12個不同品牌的發(fā)酵乳,分析不同發(fā)酵乳中苯甲酸之間的含量差異,結(jié)果見表4所示。所有樣品中均有苯甲酸的檢出,含量范圍為0.73～7.373 μg/mL,平均值為2.692 μg/mL,與譚連英等[21]報道的保質(zhì)期內(nèi)發(fā)酵乳的苯甲酸含量接近。市售酸奶中不同品牌間苯甲酸存在差異(P<0.05),分析其原因:一是不同品牌的發(fā)酵乳配料及含量存在差異,尤其是原料乳方面；二是不同廠家使用的發(fā)酵劑的類型不一,不同乳酸菌之間產(chǎn)苯甲酸能力不同；三是不同發(fā)酵乳之間的發(fā)酵時間存在差異。

表4 不同市售發(fā)酵乳中馬尿酸和苯甲酸含量差異Table 4 Difference of hippuric and benzoic acid contents in various market fermented milk

3 結(jié)論

通過研究不同含量的全脂乳粉、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、pH、乳酸菌種類5個因素，了解發(fā)酵乳中苯甲酸產(chǎn)生的影響因素。結(jié)果表明,所有發(fā)酵乳中均有苯甲酸的檢出,以上5個因素對發(fā)酵乳中苯甲酸產(chǎn)生均有一定的影響。在不同含量的全脂乳粉中,發(fā)酵乳中苯甲酸的含量與原料乳中馬尿酸水平呈正相關(guān)；在發(fā)酵過程中,當(dāng)初始pH<6時,隨著pH值的升高,苯甲酸的產(chǎn)生逐漸遞增；在發(fā)酵溫度40 ℃下,產(chǎn)生苯甲酸的含量達(dá)到最高值；乳酸菌處于生長對數(shù)期時,馬尿酸轉(zhuǎn)化苯甲酸的速度較快；在選取的5種不同發(fā)酵劑中,雙歧桿菌產(chǎn)生的苯甲酸含量最低。本研究為發(fā)酵乳中苯甲酸的監(jiān)管檢驗提供了科學(xué)參考。