豬腸源糞腸球菌的體外耐受性研究

黃顯曄，謝宇庭，張鵬宇

（1. 黑龍江省大慶市杜爾伯特縣畜牧技術(shù)服務中心，黑龍江 大慶 163000；2. 黑龍江省齊齊哈爾市畜牧總站，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

益生菌是調(diào)節(jié)宿主腸道菌群平衡的重要微生物，近年來成為研究的熱點，多項研究表明益生菌具有維持腸道菌群平衡、抑制致病菌繁殖、提高機體免疫力，降低腹瀉率及促進飼料消化吸收等功能。2019 年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的第194 號公告，鼓勵企業(yè)和研發(fā)機構(gòu)加快開發(fā)生物飼料、酶制劑、益生菌、植物提取物等抗生素替代產(chǎn)品，促進畜牧業(yè)抗生素減量替代，確保畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全，其中益生菌在畜牧獸醫(yī)行業(yè)中具有巨大的應用前景。

本試驗用糞腸球菌由仔豬直腸分離得到，經(jīng)過相關(guān)鑒定及試驗已確定其為益生菌，通過本次體外耐受性試驗，驗證其是否耐酸、耐膽鹽及耐高溫，為進一步研制微生態(tài)制劑提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株 糞腸球菌(Enterococcus faecium)DM-F16 由大慶市某豬場仔豬直腸內(nèi)容物分離獲得。

1.2 試劑及設備 LB 固體培養(yǎng)基、LB 肉湯培養(yǎng)基（山東拓普生物工程有限公司）、豬膽鹽（索萊寶科技有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）、立式小容量恒溫培養(yǎng)搖床（上海世平實驗設備有限公司）、潔凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）。

1.3 菌液制備 用無菌接種環(huán)挑取少量試驗菌株于LB 平板培養(yǎng)基上，劃線，37℃溫箱培養(yǎng)24h，挑取單一菌落，接種到LB 肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期后平板計數(shù)，取用菌液濃度為1.2×108cfu.mL-1。

1.4 糞腸球菌體外存活率計算 參考文獻方法[7]以下列公式進行計算糞腸球菌體外存活率。

1.5 菌株耐酸性試驗 用濃鹽酸調(diào)節(jié)已配制好的LB 肉湯培養(yǎng)基，pH 值分別為2.0、3.0、7.0。

按2%的量接種菌液，37℃，180r.min-1搖床內(nèi)培養(yǎng)，分別于1h、2h 和3h 取樣100μL 進行平板計數(shù)，并計算糞腸球菌體外存活率。

1.6 耐膽鹽試驗 菌種分別接種于含豬膽鹽為0.1%、0.2%、0.3%、0.5%LB 肉湯培養(yǎng)基中，接菌量為體積的2%，然后置于180r.min-1搖 床 內(nèi)37℃培 養(yǎng)，于1h、2h、4h 和8h 取 樣100μL，平板計數(shù)及計算糞腸球菌體外存活率。

1.7 高溫耐受試驗 取試驗菌液分別置于試管中，在37℃、50℃、60℃、80℃下水浴，分別于培養(yǎng)的第3min、10min、15min、30min 取樣100μL，平板計數(shù)及計算糞腸球菌體外存活率。

2 結(jié) 果

2.1 耐酸性試驗結(jié)果

糞腸球菌DM-F16 耐酸性試驗結(jié)果如表1 所示，在pH是2.0 培養(yǎng)基中，隨著時間的延長糞腸球菌的存活率明顯下降，當培養(yǎng)3h 后菌濃度下降一個數(shù)量級，存活率僅有2%左右，在pH 值為3.0 和7.0 的濃度下存活率隨著時間的延長逐漸增大，可推斷出該菌株對pH 為3.0 以上的酸度環(huán)境生長適應良好。

表1 糞腸球菌DM-F16 對不同pH 的體外存活率（%）

表2 糞腸球菌DM-F16 對不同濃度膽鹽的體外存活率（%）

2.2 耐膽鹽試驗結(jié)果

糞腸球菌DM-F16 的耐膽鹽試驗結(jié)果如表2 所示，膽鹽濃度在0.1%～0.2%能很好的生長，在濃度0.3%時隨著培養(yǎng)時間延長，存活率有所下降，在培養(yǎng)8h 后存活率僅為75.65%，說明菌株對該濃度膽鹽有一定的耐受性，但在含0.5%膽鹽的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8h 后存活率下降了90%，說明菌株對高濃度膽鹽缺少耐受性。

表3 糞腸球菌DM-F16 對不同溫度的體外存活率（%）

2.3 高溫耐受試驗結(jié)果

如表3 結(jié)果所示，菌株DM-F16 在不同溫度下培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)隨時間延長正常生長，在50℃存活率逐漸下降，培養(yǎng)30min 后取樣發(fā)現(xiàn)存活率為46.76%，60℃高溫下培養(yǎng)30min 存活率僅為21.09%，說明該菌株對高溫敏感。

3 討 論

糞腸球菌（Enterococcus faecalis）屬于革蘭氏陽性菌，在人和動物的腸道中廣泛存在，糞腸球菌具有很多毒力因子，可引起胃腸道、口腔及泌尿道等感染，另一方面該菌可產(chǎn)生細菌素等物質(zhì)抑制其他病原菌繁殖從而改善宿主腸道微環(huán)境，亦可抑制腸道中產(chǎn)尿素酶細菌和腐敗菌的繁殖降低內(nèi)毒素及血氨含量，有研究表明糞腸球菌具有較強上調(diào)腸上皮細胞SERTmRNA 和蛋白表達的作用能夠增加5-HT 的再攝取從而減弱胃腸道癥狀；因此篩選具有益生菌特性的糞腸球菌菌株并研制相關(guān)微生態(tài)制劑，其安全性、益生菌樣功能及菌株的體外耐受性是很重要的考察指標；其中體外耐受性主要是模擬菌體通過動物胃腸道，對胃腸道環(huán)境適應性、制成微生態(tài)制劑過程及成品運輸中對外界環(huán)境的抵抗能力。

本試驗菌株來源于仔豬，將主要研制成仔豬用微生態(tài)制劑，因此需要考慮仔豬腸道環(huán)境的特殊性，消化道是個復雜的環(huán)境，尤其仔豬斷奶后一段時間內(nèi)消化道環(huán)境較育成豬的變化更多：胃內(nèi)的pH 值從斷奶前的pH4.0 左右到斷奶后升高至pH5.5 左右，然后開始下降，仔豬60 日齡后漸漸達到成豬的pH3.0 左右；而腸道內(nèi)的酸度逐漸降低達到中性偏堿性，其中起主要作用的是膽汁，濃度大約在0.03%～0.3%，試驗模擬腸道中膽汁濃度進行菌株的耐膽鹽能力考查；在高溫試驗中主要是針對制劑過程中加熱溫度的考察，是否能夠耐受一定的高溫，本試驗菌株對高溫敏感，因此在研制微生態(tài)制劑過程中是重要的影響因素。

本試驗所用菌株由仔豬直腸分離得到，已通過其培養(yǎng)特征、菌落及菌體形態(tài)觀察、生理生化鑒定以及16SrDNA 序列分析已確定為糞腸球菌，又經(jīng)過一系列安全試驗及益生菌特性試驗已確定其安全性及具有益生菌作用。經(jīng)過耐酸、耐膽鹽、耐高溫試驗，結(jié)果表明分離的糞腸球菌具有較好的耐酸性及耐膽鹽能力，但對高溫敏感，試驗結(jié)果為進一步研制益生菌制劑提供了可靠數(shù)據(jù)。