孫玉明，張 婷，徐曉洋，張永俠，楊永恒，原海燕

〔江蘇省中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)，江蘇 南京 210014〕

甜菊(SteviarebaudianaBertoni)，又名甜葉菊，為菊科(Asteraceae)多年生草本植物，因其葉片中含有的甜菊糖苷具有高甜度、低熱量的特性而備受關(guān)注[1]。氮素和光照是影響植物生長發(fā)育和生理代謝過程的關(guān)鍵環(huán)境因子，在作物產(chǎn)量和品質(zhì)形成中發(fā)揮重要作用。氮素作為植物體內(nèi)氨基酸、蛋白質(zhì)以及光合同化酶的主要組成成分，可以促進(jìn)甜菊葉片的光合速率及葉片干質(zhì)量形成[2-3]。氮素還會影響甜菊葉片中甜菊糖苷含量，如Tavarini等[4]報道，甜菊葉片中不同甜菊糖苷的含量隨著施氮量的增加而逐漸升高；楊永恒等[5]認(rèn)為，隨著施氮量的增加，甜菊葉片總甜菊糖苷含量先升高后降低；而Sun等[2]和包亞英等[6]的研究則發(fā)現(xiàn)氮素會抑制甜菊糖苷的合成。因此，目前關(guān)于氮素對甜菊糖苷的影響尚沒有明確結(jié)論。光照強(qiáng)度也會影響甜菊生長及葉片品質(zhì)。與正常光照相比，弱光處理會推遲甜菊的生育進(jìn)程并抑制葉片單株干質(zhì)量形成[7]。曾小燕[8]發(fā)現(xiàn)，甜菊葉片中的游離氨基酸和蛋白質(zhì)含量隨著光照強(qiáng)度的降低先升高后降低，但是甜菊糖苷含量對光照強(qiáng)度的響應(yīng)不敏感。但目前鮮有研究關(guān)注光照和氮素的互作對甜菊生長和甜菊糖苷含量影響。

本研究選取2個遺傳背景完全不同的甜菊品種‘守田3號’(‘Shoutian No.3’)和‘中山8號’(‘Zhongshan No.8’)作為研究對象，比較不同氮素和光照條件下2個甜菊品種生長、氮素吸收以及甜菊糖苷含量和積累量的變化，旨在明確氮素和光照調(diào)控甜菊生長及甜菊糖苷含量的生理機(jī)制，為高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)甜菊的栽培管理提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為甜菊品種‘守田3號’(引自日本)和‘中山8號’(江蘇省中國科學(xué)院植物研究所自主選育)的1年生扦插苗，栽種于江蘇省中國科學(xué)院植物研究所甜菊種植資源圃。供試土壤取自林下，土壤中有機(jī)質(zhì)含量27.22 mg·g-1、全氮含量1.53 mg·g-1、速效磷含量63.97 mg·g-1、速效鉀含量347.72 mg·g-1，pH 6.72。實驗在江蘇省中國科學(xué)院植物研究所溫室進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 實驗設(shè)計 采用雙因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計。設(shè)置不施氮(N0)和施氮(N)2個處理。每盆裝土約12.5 kg，參考文獻(xiàn)[2]，每盆磷肥和鉀肥用量分別為4.16 g過磷酸鈣(P2O5含量12%)和0.7 g氯化鉀(K2O含量60%)，裝盆時一次性施入。施氮處理每盆氮肥用量為3.63 g尿素(總氮含量大于等于46%)，分別于裝盆時(5月24日)和移栽后約1個月(6月20日)各施入50%。每個氮素處理再設(shè)置正常光照(LN)和弱光(LW)2個處理。正常光照處理為日光光照，光照強(qiáng)度約為1 000 μmol·m-2·s-1；弱光處理在盆栽上方搭建黑色中性尼龍網(wǎng)遮光，光照強(qiáng)度約為250 μmol·m-2·s-1。于5月25日移栽甜菊扦插苗，每盆3株，每處理4盆(記為4次重復(fù))。于7月1日開始弱光處理，連續(xù)處理2周后于7月15日(移栽后50 d)從每盆中隨機(jī)選取1株進(jìn)行各項指標(biāo)的測定。

1.2.2 指標(biāo)測定方法

1.2.2.1 樣品采集 距甜菊莖基部2 cm處收割后帶回實驗室，用蒸餾水清洗樣品后將葉片和莖分離。將每株甜菊所有葉片在標(biāo)尺背景下拍照并使用Image J軟件(Image-Pro Plus 6.0)統(tǒng)計葉面積。然后分別于105 ℃烘箱中殺青30 min，再于70 ℃烘干至恒質(zhì)量，使用JJ1000型百分之一電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠)分別稱取干質(zhì)量，然后計算甜菊的單株地上部干質(zhì)量(單株葉片干質(zhì)量和單株莖干質(zhì)量之和)、葉莖比(單株葉片干質(zhì)量與單株莖干質(zhì)量的比值)和比葉質(zhì)量(單株葉片干質(zhì)量與單株葉面積的比值)。

1.2.2.2 葉片葉綠素相對含量(SPAD)測定 使用SPAD-502便攜式葉綠素測定儀(日本柯尼卡美能達(dá)公司)測定完全展開新葉的SPAD值。每枚葉片隨機(jī)選取6個點(diǎn)(避開葉脈)測定，計算平均值。

1.2.2.3 氮素含量測定 參考文獻(xiàn)[9]，將干樣磨碎后，準(zhǔn)確稱取0.05 g樣品，采用H2SO4-H2O2法高溫消解，定容后使用KDY-9820凱氏定氮儀(北京瑞邦興業(yè)科技有限公司)通過凱氏定氮法測定消化液中的氮素濃度。甜菊各部位中氮素的含量、單株積累量以及分配比例分別根據(jù)以下公式進(jìn)行計算：某部位氮素含量=某部位氮素濃度×消化液體積/樣品質(zhì)量；單株某部位氮素積累量=某部位氮素含量×單株該部位干質(zhì)量；某部位氮素分配比例=(單株某部位氮素積累量/單株各部位氮素積累量之和)×100%。

1.2.2.4 葉片中甜菊糖苷的提取和測定 稱取甜菊葉片樣品約0.1 g，參考文獻(xiàn)[2]提取甜菊糖苷，使用LC-100高效液相色譜儀(包括紫外檢測器和色譜工作站)(上海伍豐科學(xué)儀器有限公司)測定甜菊糖苷含量。色譜柱為Hypersil-NH2(4.6 mm×250.0 mm，5 μm)(大連依利特分析儀器有限公司)，工作溫度25 ℃，波長210 nm，進(jìn)樣量10 μL。流動相為乙腈-磷酸緩沖液(體積比32∶68)，流速1 mL·min-1。

分別稱取甜菊苷、萊鮑迪苷A和萊鮑迪苷C標(biāo)準(zhǔn)品(日本和光純藥工業(yè)株式會社，純度均大于99.0%)，用甲醇(色譜級)分別配置質(zhì)量濃度0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用上述色譜條件分別測定3種標(biāo)準(zhǔn)品溶液中各甜菊糖苷含量。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)(y)、峰面積為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。甜菊苷、萊鮑迪苷A和萊鮑迪苷C的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：y甜菊苷=0.000 2x-0.045 0；y萊鮑迪苷A=0.000 3x-0.057 3；y萊鮑迪苷C=0.000 24x-0.053 00。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程換算樣品提取液中的甜菊糖苷濃度。各甜菊糖苷含量、總甜菊糖苷含量和單株總甜菊糖苷積累量分別根據(jù)下列公式進(jìn)行計算：某甜菊糖苷含量=〔(某甜菊糖苷濃度×樣品提取液體積/樣品質(zhì)量)/10〕×100%；總甜菊糖苷含量=甜菊苷含量+萊鮑迪苷A含量+萊鮑迪苷C含量；單株總甜菊糖苷積累量=(總甜菊糖苷含量×單株葉片干質(zhì)量/100)×1 000。

1.2.2.5 葉片可溶性糖含量測定 參考王學(xué)奎[10]的方法測定葉片樣品中的可溶性糖含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用EXCEL 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncan’s多重范圍檢驗進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果和分析

2.1 氮素和光照對2個甜菊品種生長和葉片葉綠素相對含量(SPAD)的影響

氮素和光照對2個甜菊品種生長指標(biāo)和葉片SPAD值的影響見表1。由表1可見：正常光照處理下，與不施氮處理相比，施氮處理下2個甜菊品種單株葉片干質(zhì)量、單株莖干質(zhì)量、單株地上部干質(zhì)量、單株葉面積和葉片SPAD值顯著升高，葉莖比和比葉質(zhì)量顯著或不顯著降低；弱光處理下，與不施氮處理相比，施氮處理下2個甜菊品種單株葉面積和葉片SPAD值顯著升高，比葉質(zhì)量顯著降低，其他指標(biāo)無顯著變化。

由表1還可見：同一氮素處理下，與正常光照處理相比，弱光處理下甜菊品種‘守田3號’單株葉片干質(zhì)量、單株莖干質(zhì)量、單株地上部干質(zhì)量、葉莖比、單株葉面積、比葉質(zhì)量和葉片SPAD值總體上顯著降低。施氮處理下，與正常光照處理相比，弱光處理下甜菊品種‘中山8號’上述指標(biāo)顯著降低；而不施氮處理下，與正常光照處理相比，弱光處理下甜菊品種‘中山8號’葉莖比和比葉質(zhì)量顯著降低，其他指標(biāo)無顯著變化。

表1 氮素和光照對2個甜菊品種生長指標(biāo)和葉片葉綠素相對含量(SPAD)的影響

方差分析結(jié)果顯示：氮素和光照對甜菊上述生長指標(biāo)和葉片SPAD值有顯著或極顯著影響。氮素與光照的互作對甜菊單株葉片干質(zhì)量、單株莖干質(zhì)量、單株地上部干質(zhì)量和單株葉面積有極顯著影響，而對葉莖比、比葉質(zhì)量和葉片SPAD值無顯著影響。氮素與品種的互作以及光照與品種的互作對甜菊葉莖比、單株葉面積、比葉質(zhì)量和葉片SPAD值有顯著或極顯著影響，而對單株葉片干質(zhì)量、單株莖干質(zhì)量、單株地上部干質(zhì)量無顯著影響。氮素、光照與品種的互作對甜菊單株葉片干質(zhì)量和單株葉面積有極顯著影響。

2.2 氮素和光照對2個甜菊品種氮素含量、積累量及分配比例的影響

氮素和光照對2個甜菊品種氮素含量、積累量及分配比例的影響見表2。由表2可見：同一品種和光照處理下，與不施氮處理相比，施氮處理下2個甜菊品種葉片和莖中氮素含量分別升高了5.3%～26.4%和5.8%～35.6%，總體上差異達(dá)顯著水平。同一品種和氮素處理下，與正常光照處理相比，弱光處理下2個甜菊品種葉片中氮素含量升高了20.7%～42.5%，差異達(dá)顯著水平。不施氮處理下，與正常光照處理相比，弱光處理下2個甜菊品種莖中氮素含量顯著升高；但施氮處理下，與正常光照處理相比，弱光處理下2個甜菊品種莖中氮素含量無顯著變化。

由表2還可見：同一品種和光照處理下，與不施氮處理相比，施氮處理下2個甜菊品種單株葉片和莖中氮素積累量分別升高了71.4%～243.8%和72.9%～323.1%。而同一品種和氮素處理下，與正常光照處理相比，弱光處理下甜菊單株葉片和莖中氮素積累量有不同程度的降低。

由表2還可見：同一光照處理下，與不施氮處理相比，施氮處理下甜菊品種‘守田3號’葉片氮素分配比例顯著降低，莖氮素分配比例顯著升高；甜菊品種‘中山8號’葉片和莖的氮素分配比例無顯著變化。同一品種和氮素處理下，與正常光照處理相比，弱光處理下2個甜菊品種葉片氮素分配比例有不同程度的降低，莖氮素分配比例則有不同程度的升高。此外，在同一氮素和光照處理下，甜菊品種‘中山8號’葉片氮素分配比例高于甜菊品種‘守田3號’，而其莖氮素分配比例低于甜菊品種‘守田3號’。

表2 氮素和光照對2個甜菊品種氮素含量、積累量及分配比例的影響

方差分析結(jié)果顯示：氮素和光照對甜菊葉片和莖的氮素含量、單株氮素積累量和氮素分配比例有顯著或極顯著影響。氮素與光照的互作對甜菊葉片和莖的單株氮素積累量有極顯著影響，但是對葉片和莖的氮素含量和氮素分配比例無顯著影響。氮素與品種的互作對甜菊葉片中氮素含量和單株總氮積累量以及葉片和莖的氮素分配比例有顯著或極顯著影響，光照與品種的互作僅對甜菊葉片中氮素含量有顯著影響。氮素、光強(qiáng)與品種的互作對甜菊上述指標(biāo)均無顯著影響。

2.3 氮素和光照對2個甜菊品種葉片中甜菊糖苷含量和積累量以及可溶性糖含量的影響

氮素和光照對2個甜菊品種葉片中甜菊糖苷含量和積累量以及可溶性糖含量的影響見表3。由表3可見：同一品種和光照處理下，與不施氮處理相比，施氮處理下2個甜菊品種葉片中甜菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷C和總甜菊糖苷的含量分別降低了16.6%～31.8%、8.9%～28.4%、7.1%～17.5%和14.5%～27.0%。同一氮素處理下，與正常光照相比，弱光處理下甜菊品種‘守田3號’葉片中3種甜菊糖苷含量和總甜菊糖苷含量無顯著變化。不施氮處理下，與正常光照處理相比，弱光處理下甜菊品種‘中山8號’葉片中甜菊苷、萊鮑迪苷A和總甜菊糖苷的含量顯著降低，萊鮑迪苷C含量無顯著變化；施氮處理下，與正常光照處理相比，弱光處理對甜菊品種‘中山8號’葉片中3種甜菊糖苷含量和總甜菊糖苷含量無顯著影響。此外，同一光照和氮素處理下，與甜菊品種‘守田3號’相比，甜菊品種‘中山8號’葉片中甜菊苷含量較高而萊鮑迪苷A含量較低，但是2個甜菊品種葉片中萊鮑迪苷C含量接近。

由表3還可見：正常光照處理下，與不施氮處理相比，施氮處理下2個甜菊品種單株總甜菊糖苷積累量顯著升高；弱光處理下，與不施氮處理相比，施氮處理對2個甜菊品種單株總甜菊糖苷積累量的影響不顯著。同一品種和氮素處理下，與正常光照處理相比，弱光處理下甜菊單株總甜菊糖苷積累量降低了64.5%～73.5%，差異達(dá)顯著水平。

由表3還可見：同一品種和氮素處理下，與正常光照處理相比，弱光處理顯著降低了甜菊品種‘中山8號’葉片中可溶性糖含量，但是對甜菊品種‘守田3號’葉片中可溶性糖含量無顯著影響。正常光照處理下，與不施氮處理相比，施氮處理下2個甜菊品種葉片中可溶性糖含量顯著降低；弱光處理下，與不施氮處理相比，施氮處理對2個甜菊品種葉片中可溶性糖含量無顯著影響。

表3 氮素和光照對2個甜菊品種葉片中甜菊糖苷含量和積累量以及可溶性糖含量的影響

方差分析結(jié)果顯示：氮素對甜菊葉片中3種甜菊糖苷含量、總甜菊糖苷含量和可溶性糖含量以及單株總甜菊糖苷積累量有顯著或極顯著影響；光照對甜菊苷含量和可溶性糖含量以及單株總甜菊糖苷積累量有極顯著影響。氮素與光照的互作對甜菊葉片中甜菊苷、萊鮑迪苷A、總甜菊糖苷和可溶性糖的含量以及單株總甜菊糖苷積累量有顯著或極顯著影響，對萊鮑迪苷C含量無顯著影響。氮素與品種的互作僅對甜菊葉片中甜菊苷含量有顯著影響，光照與品種的互作對甜菊苷、總甜菊糖苷和可溶性糖的含量有極顯著影響，氮素與品種以及光照與品種的互作對萊鮑迪苷A和萊鮑迪苷C的含量以及單株總甜菊糖苷積累量無顯著影響。氮素、光照與品種的互作對甜菊葉片中甜菊苷和可溶性糖的含量有顯著影響。

3 討論和結(jié)論

氮素和光照是影響植物葉片光合速率的關(guān)鍵環(huán)境因子，缺氮或弱光條件下，植物葉片光合速率及葉綠素?zé)晒庑曙@著降低，植物的干質(zhì)量形成受到抑制[11-12]。本研究中，與正常光照或施氮處理相比，弱光及不施氮處理下甜菊品種‘中山8號’和‘守田3號’單株葉片干質(zhì)量、單株莖干質(zhì)量和葉片葉綠素相對含量總體上顯著降低。比葉質(zhì)量和葉莖比是衡量植物響應(yīng)環(huán)境變化的重要指標(biāo)。Poorter等[13]研究認(rèn)為，低光照水平會導(dǎo)致植物的干質(zhì)量更多地向莖分配，而營養(yǎng)缺乏則會降低干質(zhì)量向葉片分配的比例。Yao等[14]的研究結(jié)果表明：棉花(GossypiumhirsutumLinn.)可以通過調(diào)整比葉質(zhì)量優(yōu)化冠層對光照和氮素的利用效率。本研究中，弱光和氮素處理均會影響甜菊的葉莖比和比葉質(zhì)量，甜菊通過改變自身干質(zhì)量的分配比例和葉片形態(tài)適應(yīng)外界環(huán)境變化[15]。

氮素是核酸、蛋白質(zhì)及酶的關(guān)鍵組成成分，參與植物生長發(fā)育的各個環(huán)節(jié)，植物體內(nèi)的氮素含量及積累特征是影響干質(zhì)量的關(guān)鍵因子[16-17]。本研究中，與正常光照相比，弱光處理下2個甜菊品種葉片和莖中氮素含量總體上顯著升高，這可能與弱光條件下植物生長受阻造成的氮素“濃縮效應(yīng)”[18]有關(guān)。施氮可以緩解弱光對植物生長的抑制作用[12，19]。本研究中，弱光處理下，施氮處理下甜菊的干質(zhì)量和氮素含量較不施氮處理升高，說明適當(dāng)增施氮肥能有效調(diào)節(jié)植物在弱光條件下的氮素吸收和生長發(fā)育。

總體上看，施氮處理下2個甜菊品種葉片中甜菊糖苷含量較不施氮處理顯著降低，弱光處理下甜菊糖苷含量與正常光照處理相比無顯著變化，與前人的研究結(jié)果[2，6，8]一致。Yoneda等[20]的研究表明：光質(zhì)變化會顯著影響甜菊糖苷合成，但是光照強(qiáng)度的改變對KO、UGT85C2、UGT74G1和UGT76G1等甜菊糖苷合成關(guān)鍵基因的表達(dá)并無顯著影響。值得注意的是，不施氮處理下，弱光處理下甜菊品種‘中山8號’葉片中總甜菊糖苷含量較正常光照處理顯著降低，說明不同甜菊品種的光敏感性存在差異，且施氮可以緩解弱光處理對甜菊糖苷合成的抑制作用。

施氮和弱光處理下，2個甜菊品種葉片中可溶性糖含量的變化趨勢與總甜菊糖苷含量基本一致，表明氮素可能通過影響甜菊體內(nèi)的碳代謝以及糖酵解過程調(diào)控甜菊糖苷合成底物的含量[21]。此外，對海濱木巴戟(MorindacitrifoliaLinn.)[22]和丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)[23]的研究結(jié)果也顯示：適量噴施蔗糖能有效提高植物體內(nèi)碳基次級代謝產(chǎn)物的合成，進(jìn)一步證明糖代謝在甜菊糖苷合成調(diào)控中具有重要作用。

在實際生產(chǎn)中，與單一的甜菊產(chǎn)量或葉片品質(zhì)相比，甜菊葉片中總甜菊糖苷積累量最終決定其經(jīng)濟(jì)價值。本研究中，與正常光照和施氮處理相比，弱光或不施氮處理總體上顯著降低了甜菊單株總甜菊糖苷積累量。此外，甜菊單株總甜菊糖苷積累量的變化與單株葉片干質(zhì)量的變化更為接近，而與總甜菊糖苷含量的變化不同，推測造成這種現(xiàn)象的主要原因是植物“生長-分化/防御平衡”的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制。植物處于不利環(huán)境時，由于自身資源的限制，通過一系列的調(diào)控機(jī)制介導(dǎo)生長和分化之間的平衡[24-25]。弱光處理下，植物傾向于提高次級代謝而抑制植物生長，從而提高其防御和生存能力；反之，盡管施氮提高了甜菊的葉片干質(zhì)量，但抑制了甜菊糖苷的合成。

綜上所述，供試2個甜菊品種的干質(zhì)量和氮素含量均受光照和氮素水平的影響，而葉片甜菊糖苷含量主要受氮素水平的調(diào)控。此外，甜菊葉片甜菊糖苷含量與可溶性糖含量的變化有關(guān)。在甜菊的栽培生產(chǎn)過程中，應(yīng)根據(jù)甜菊品種特性進(jìn)行氮素和光照管理，從而獲取高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的甜菊葉片。