胡 芃,鄭 藝,趙于飛*,吳愛(ài)林,毛云飛,常 娜

(1 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院西區(qū)腫瘤放射治療科,合肥 230001;2 安徽省腫瘤醫(yī)院腫瘤放射治療科;*通訊作者,E-mail:672827431@qq.com)

肺癌是發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤,然而多數(shù)化療藥物都具有不可忽略的毒副作用,因此尋求低毒高效的治療藥物迫在眉睫。老藥新用,開(kāi)發(fā)已上市藥物新的適應(yīng)證可以節(jié)省藥物研發(fā)的成本和時(shí)間,也可以保證藥物的低毒性,因此是開(kāi)發(fā)低毒高效腫瘤治療藥物的可靠途徑。他汀類(lèi)藥物是臨床上廣泛應(yīng)用的一線降脂藥物,通過(guò)抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMGCR)從而抑制下游膽固醇的合成。有研究顯示他汀具有抗腫瘤活性[1-3],但對(duì)肺癌的作用及機(jī)制研究并不十分明確。Hippo信號(hào)通路是負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)組織器官大小的信號(hào)通路,在進(jìn)化上高度保守,其下游核心蛋白分子為YAP和TAZ兩個(gè)輔助轉(zhuǎn)錄因子,YAP和TAZ可以入核,與TEAD轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成復(fù)合物,促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄[4]。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程,TAZ被證實(shí)參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展,抑制YAP/TAZ能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[5,6]。本研究以A549肺癌細(xì)胞為研究對(duì)象,考察洛伐他汀對(duì)A549肺癌細(xì)胞的增殖及凋亡的影響,并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 洛伐他汀購(gòu)于美國(guó)MedChemExpress(HY-N0504)。RPMI-1640含雙抗(100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)培養(yǎng)基購(gòu)于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。RIPA裂解液(P0013C)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京碧云天生物技術(shù)有限公司?？俁NA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司。ECL發(fā)光液購(gòu)于上海天能科技有限公司。mTOR、AKT、Caspase-3、cleaved Caspase-3、Caspase-9、cleaved Caspase-9、PARP、cleaved PARP、GAPDH抗體、羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG購(gòu)于武漢Proteintech。p-mTOR(Ser2448)、p-AKT(Ser473)、p70S6k、p-p70S6k(Ser371)、TAZ抗體購(gòu)于美國(guó)CST。

1.1.2 細(xì)胞株 A549肺癌細(xì)胞株,購(gòu)買(mǎi)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.3 儀器 血球計(jì)數(shù)儀,Corning公司(美國(guó));酶標(biāo)儀,BioTek公司(美國(guó));臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),Thermo公司(美國(guó));微型離心機(jī),Corning公司(美國(guó));CytoFLEX流式細(xì)胞儀,Beckman Coulter公司(美國(guó));電泳儀,Bio-Rad公司(美國(guó));MicroChemi化學(xué)發(fā)光型凝膠成像系統(tǒng),Azure公司(美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549肺癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,孵箱培養(yǎng)條件:37 ℃,5% CO2。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 A549肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)至適宜密度時(shí),消化、離心,新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后采用血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù),將A549肺癌細(xì)胞均勻鋪于96孔板中,每孔約為1 000個(gè)細(xì)胞,次日,細(xì)胞貼壁后給與不同濃度洛伐他汀(20,40,80 μmol/L),每組6個(gè)復(fù)孔,置于孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h(時(shí)間依賴(lài)性實(shí)驗(yàn)則加入40 μmol/L洛伐他汀,培養(yǎng)12,24,48 h),實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h加入20 μl濃度為5 mg/ml的MTT,4 h后吸走96孔板中液體,加入120-180 μl DMSO,輕輕搖晃細(xì)胞培養(yǎng)板,使底部結(jié)晶充分溶解后490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值,根據(jù)光吸收值換算出抑制率。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè) A549肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)至適宜密度時(shí),消化、離心,新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后采用血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù),取約2×106個(gè)細(xì)胞均勻鋪于6孔板中,次日,加入不同濃度的洛伐他汀(20,40,80 μmol/L)處理24 h,收集培養(yǎng)基上清并1 000 r/min離心5 min沉淀上清中的細(xì)胞,消化貼壁細(xì)胞后500 r/min離心5 min后PBS重懸并合并細(xì)胞,用PBS洗滌2次后加入500 μl Binding Buffer、5 μl Annexin Ⅴ-FITC和5 μl PI,避光孵育5 min后,采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) A549肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)至適宜密度時(shí),消化、離心,新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后采用血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù),每孔取約2×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板,包括對(duì)照組和3個(gè)不同濃度洛伐他汀(20,40,80 μmol/L)處理組。洛伐他汀處理A549肺癌細(xì)胞24 h后,收集細(xì)胞樣本,12 000g離心15 min后吸取上清置于另外干凈1.5 ml離心管中,加入1/4體積5×loading buffer,混勻后100 ℃處理5-10 min,置于-20 ℃?zhèn)溆谩？疾霻AZ在洛伐他汀抗A549細(xì)胞增殖中的作用時(shí),預(yù)先轉(zhuǎn)染TAZ質(zhì)粒,48 h后加入40 μmol/L洛伐他汀繼續(xù)處理24 h后收取蛋白樣品,12 000g離心15 min后吸取上清置于另外干凈1.5 ml離心管中,加入1/4體積5×loading buffer,混勻后100 ℃處理5-10 min,置于-20 ℃?zhèn)溆?。制備SDS-PAGE凝膠,根據(jù)待檢測(cè)蛋白的分子量和SDS-PAGE凝膠的最佳分子范圍選擇配制適合濃度的SDS-PAGE凝膠,cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9采用12%的凝膠,mTOR、p-mTOR采用6%的凝膠,其余蛋白采用10%的凝膠。電泳采用兩步法,Step 1電壓80 V,40 min,Step 2電壓120 V,60 min。濕轉(zhuǎn),根據(jù)待檢測(cè)蛋白的分子量決定濕轉(zhuǎn)時(shí)間,濕轉(zhuǎn)電壓維持在80 V以上;5%脫脂奶粉或5% BSA室溫封閉1-2 h;一抗4 ℃孵育過(guò)夜;二抗室溫孵育1 h;ECL發(fā)光液顯影。

1.2.5 TAZ質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染 TAZ過(guò)表達(dá)質(zhì)粒為pBabe puro-mTAZ plasmid(Addgene plasmid#31791)。A549肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)至適宜密度時(shí),消化、離心,新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后采用血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù),每孔取數(shù)量約2×106個(gè)細(xì)胞均勻鋪于6孔板中,次日待細(xì)胞貼壁后,用Opti-MEM培養(yǎng)基預(yù)混1 μg對(duì)照質(zhì)?；騎AZ過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和2 μl Lipo 3000后加入培養(yǎng)板中處理6-8 h,更換新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞RNA和蛋白樣品,采用qRT-PCR和Western blot分別在mRNA和蛋白水平驗(yàn)證TAZ的表達(dá)。考察TAZ在洛伐他汀抗A549細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)A549凋亡中的作用時(shí),A549細(xì)胞預(yù)先轉(zhuǎn)染TAZ過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,48 h后給于洛伐他汀進(jìn)行干預(yù)。

1.2.6 qRT-PCR 總RNA提取:不同濃度的洛伐他汀(20,40,80 μmol/L)處理A549細(xì)胞24 h后,采用RNA提取試劑盒提取總的RNA。RT-PCR:采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄處理,逆轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?2 ℃ 2 min,85 ℃ 5 min,4 ℃保存。qRT-PCR:95 ℃ 2 min;94 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s,68 ℃ 30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán);65-95 ℃制備溶解曲線。引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 洛伐他汀抑制A549肺癌細(xì)胞的增殖

20,40,80 μmol/L的洛伐他汀處理A549細(xì)胞24 h,MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著洛伐他汀濃度的增加,A549肺癌細(xì)胞的存活率逐漸降低,40 μmol/L洛伐他汀組與20 μmol/L洛伐他汀組相比,A549肺癌細(xì)胞的存活率降低(P<0.05),80 μmol/L洛伐他汀組與40 μmol/L洛伐他汀組相比,A549肺癌細(xì)胞的存活率顯著降低(P<0.05),80 μmol/L洛伐他汀組與20 μmol/L洛伐他汀組相比,A549肺癌細(xì)胞的存活率顯著降低(P<0.05,見(jiàn)圖1)。40 μmol/L洛伐他汀處理A549細(xì)胞12,24,48 h,隨著作用時(shí)間的增加,A549細(xì)胞的存活率逐漸降低,24 h組與12 h組相比,A549肺癌細(xì)胞的存活率降低(P<0.05);48 h組與24 h組相比,A549肺癌細(xì)胞的存活率顯著降低(P<0.05);48 h組與12 h組相比,A549肺癌細(xì)胞的存活率顯著降低(P<0.05,見(jiàn)圖1)。以上結(jié)果表明洛伐他汀可以濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性地抑制A549肺癌細(xì)胞的增殖。

2.2 洛伐他汀抑制mTOR信號(hào)通路

mTOR信號(hào)通路負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞的增殖,采用Western blot考察洛伐他汀對(duì)mTOR信號(hào)通路的影響,Western blot結(jié)果顯示,隨著洛伐他汀濃度的增加,p-AKT,p-mTOR和p-p70S6k的表達(dá)逐漸降低(P<0.05,見(jiàn)圖2)。該結(jié)果從分子水平證實(shí)了洛伐他汀對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用。

圖1 洛伐他汀抑制A549細(xì)胞的增殖Figure 1 Lovastatin inhibits the proliferation of A549 cells

與0 μmol/L相比,* P <0.05圖2 洛伐他汀抑制mTOR信號(hào)通路Figure 2 Lovastatin inhibits mTOR signaling pathway in A549 cells

2.3 洛伐他汀誘導(dǎo)A549肺癌細(xì)胞凋亡

細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果顯示,隨著洛伐他汀濃度的增加,A549細(xì)胞的凋亡率不斷增加,0,20,40,80 μmol/L洛伐他汀處理后細(xì)胞凋亡率依次為(10.21±1.45)%,(22.29±4.31)%,(57.27±4.56)%,(62.58±3.43)%。與0 μmol/L組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖3)。表明洛伐他汀可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖3 洛伐他汀誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡Figure 3 Lovastatin induces apoptosis of A549 cells

2.4 洛伐他汀增加Caspase-3、Caspase-9、PARP的剪切

采用Western blot考察洛伐他汀對(duì)A549細(xì)胞凋亡標(biāo)記物Caspase-9、Caspase-3和PARP剪切的影響,結(jié)果見(jiàn)圖4。隨著洛伐他汀濃度的增加,Caspase-9、Caspase-3和PARP剪切,即cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3和cleaved PARP的表達(dá)增加(P<0.05)。該結(jié)果在分子水平證實(shí)了洛伐他汀誘導(dǎo)了A549細(xì)胞發(fā)生凋亡。

與0 μmol/L相比,* P <0.05圖4 洛伐他汀促進(jìn)Caspase-9、Caspase-3和PARP的剪切Figure 4 Lovastatin increased the cleavage of Caspase-9, Caspase-3 and PARP

2.5 洛伐他汀抑制A549肺癌細(xì)胞中TAZ的表達(dá)

Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著洛伐他汀濃度的增加,A549細(xì)胞中TAZ的表達(dá)逐漸減少(P<0.05),與0 μmol/L比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖5),該結(jié)果表明洛伐他汀可以濃度依賴(lài)性地抑制A549細(xì)胞中TAZ的表達(dá)。

與0 μmol/L相比,* P <0.05圖5 洛伐他汀抑制TAZ的表達(dá)Figure 5 Lovastatin inhibits TAZ expression in A549 cells

2.6 過(guò)表達(dá)TAZ減弱了洛伐他汀對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用

采用TAZ過(guò)表達(dá)質(zhì)粒在A549細(xì)胞中過(guò)表達(dá)TAZ,結(jié)果TAZ在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05,見(jiàn)圖6)。流式結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)TAZ后,洛伐他汀對(duì)A549細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用明顯減弱,單獨(dú)洛伐他汀(40 μmol/L)組的凋亡率為(53.56±3.87)%,洛伐他汀(40 μmol/L)聯(lián)合TAZ過(guò)表達(dá)組的凋亡率為(12.11±2.58)%,兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖7)。單獨(dú)洛伐他汀(40 μmol/L)組的增殖抑制率為(51.43±4.82)%,洛伐他汀(40 μmol/L)聯(lián)合TAZ過(guò)表達(dá)組的增殖抑制率為(9.35±3.55)%,洛伐他汀對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制作用被明顯逆轉(zhuǎn),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這些結(jié)果證明TAZ介導(dǎo)了洛伐他汀對(duì)A549細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用和增殖抑制作用。

與對(duì)照組比較,* P <0.05圖6 TAZ過(guò)表達(dá)效率驗(yàn)證Figure 6 The efficiency of TAZ overexpression in A549 cells

圖7 過(guò)表達(dá)TAZ逆轉(zhuǎn)了洛伐他汀對(duì)A549細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用和增殖抑制作用Figure 7 TAZ overexpression reverses pro-apoptosis effect and anti-proliferative effect of lovastatin in A549 cells

3 討論

他汀類(lèi)藥物是臨床上最為常見(jiàn)的降膽固醇藥物,其作用機(jī)制是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制HMG-CoA還原酶的活性抑制甲羥戊酸的生成從而抑制下游膽固醇的合成。除了抑制膽固醇的合成之外,他汀類(lèi)藥物也具有抗腫瘤活性。本研究證實(shí)了洛伐他汀對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的增殖作用和凋亡誘導(dǎo)作用,機(jī)制研究提示TAZ可能在洛伐他汀抗A549增殖中發(fā)揮重要作用。

研究結(jié)果表明,洛伐他汀誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡,凋亡是細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由基因控制的自主有序的死亡。通常表型為核濃縮、起皺、膜發(fā)泡以及DNA片段化,可由兩種途徑介導(dǎo):一是TNF-α介導(dǎo)的死亡受體途徑,又稱(chēng)外源性途徑;二是線粒體途徑,又稱(chēng)內(nèi)源性途徑[7]。Caspase-9的剪切增加是線粒體途徑激活的標(biāo)志之一,由此可以判定,洛伐他汀通過(guò)激活了線粒體途徑誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。

他汀作為降膽固醇藥物通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制HMG-CoA還原酶的活性抑制膽固醇合成的同時(shí),也抑制了甲羥戊酸通路中其他中間代謝產(chǎn)物的合成,從而抑制異戊烯的合成,從而影響到蛋白的異戊烯化,抑制小G蛋白(small GTPase)的生理功能[8-10]。因此可推測(cè),洛伐他汀可能通過(guò)抑制了某小G蛋白的生理活性從而影響到Hippo信號(hào)通路。TAZ是Hippo信號(hào)通路下游的核心成員,TAZ能夠入核與TEAD家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄[11,12]。TAZ可受上游Hippo信號(hào)通路中LATS1/2的磷酸化導(dǎo)致TAZ無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞核,使TAZ滯留在胞質(zhì)中從而被降解[13]。有研究表明,TAZ能夠調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡[14,15],本研究發(fā)現(xiàn)洛伐他汀在抑制A549細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡的同時(shí)促進(jìn)了TAZ的降解,由此可推斷,洛伐他汀可能通過(guò)了下調(diào)TAZ誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡,抑制其增殖。此外,他汀類(lèi)藥物作為臨床上的常用藥物,或許可以免去新藥研發(fā)中的眾多臨床前實(shí)驗(yàn)步驟,這種“老藥新用”的模式對(duì)于藥物的開(kāi)發(fā)具有積極的意義。

綜上所述,本研究證實(shí)了洛伐他汀對(duì)A549肺癌細(xì)胞的增殖抑制作用,并對(duì)其機(jī)制做了初步探討,為他汀類(lèi)藥物在臨床上應(yīng)用于肺癌的治療提供了理論依據(jù)。