秦雪梅,孫 青*,曹德林,李菊紅,高 萍,郭志強(qiáng)

(1 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院耳鼻喉科,上海 201700;2 上海市青浦區(qū)朱家角人民醫(yī)院耳鼻喉科;*通訊作者,E-mail:13611976156@163.com)

老年性聾是指聽覺器官隨著年齡的增長而老化和退化,導(dǎo)致雙耳的感音神經(jīng)性聽力損失。在此過程之中,首先是高頻,逐漸發(fā)展為中低頻,同時相應(yīng)的言語辨別能力也會出現(xiàn)比較明顯的下降,值得注意的是,言語辨別力的損失相對較高,即言語識別率的閾值高于語音區(qū)域中純音的閾值[1]。造成老年性聾的因素涉及多方面,包括生理學(xué)、病理學(xué)、生物化學(xué)和分子學(xué),相對應(yīng)的發(fā)病機(jī)制也非常復(fù)雜,是多種因素共同作用之后所得到的結(jié)果。隨著全球老齡化問題的日益突出,全社會越來越重視老年性聾,學(xué)者們也借助多種先進(jìn)手段對老年性聾的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了越來越深入的探索。但是,目前對其發(fā)病機(jī)制尚未完全理解,這使得在老年性聾的預(yù)防和治療方面難以取得重大突破。

近年來,研究表明耳蝸是老年性耳聾發(fā)生后最容易受損的部位,耳蝸受血流的影響非常明顯,即便只出現(xiàn)輕微的血液微循環(huán)變化,也可能損傷內(nèi)耳功能。而血脂代謝狀況、凝血功能狀況對機(jī)體血液微循環(huán)有著非常重要的影響。促紅細(xì)胞生成素(EPO)是一種激素糖蛋白分子,可以促進(jìn)機(jī)體血液微循環(huán),主要由胎兒肝臟和成年人腎臟產(chǎn)生,是具有分子量46 kD的糖蛋白細(xì)胞因子。近年來,研究發(fā)現(xiàn)[1]促紅細(xì)胞生成素和血管內(nèi)皮因子對分化和成熟細(xì)胞(例如神經(jīng)細(xì)胞)具有明顯的保護(hù)作用,并且它們的神經(jīng)保護(hù)作用可以通過抑制細(xì)胞凋亡來實現(xiàn),能夠使得促炎細(xì)胞因子,如白介素(IL)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的正常表達(dá)以及分泌受到明顯抑制,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血缺氧性損傷、視網(wǎng)膜疾病和癲癇中起重要的神經(jīng)保護(hù)作用[2-4]。也有研究結(jié)果證實,對于因使用慶大霉素或者缺血而導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞以及毛細(xì)胞,EPO可以起到有效的保護(hù)作用[5]。基于以上研究基礎(chǔ),我們建立老年性聾小鼠模型,應(yīng)用EPO進(jìn)行干預(yù),探討其對血清和耳蝸中TNF-α、IL-6和IL-17的調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

5周齡清潔級昆明小鼠60只,體質(zhì)量(22±2)g,雌雄不限,耳廓反射正常,由南京大學(xué)動物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 分組 小鼠在常溫安靜狀態(tài)下喂養(yǎng),自由飲水,給與7 d的適應(yīng)性喂養(yǎng)。標(biāo)記稱重后,隨機(jī)分為空白對照組和造模組。造模組進(jìn)一步隨機(jī)分為EPO組、生理鹽水組和模型組,每個組各15只小鼠。

1.2.2 造模方法 參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-9],每只小鼠腹腔注射濃度為150 mg/(kg·d)的D-半乳糖溶液,每日1次,連續(xù)60 d。

1.2.3 干預(yù)方法 EPO組和生理鹽水組分別進(jìn)行腹腔注射1 000 U/kg EPO和等量生理鹽水,均為2次/周,共8周。

1.2.4 標(biāo)本采集 治療結(jié)束后,小鼠腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉,沿腹中線剪開腹部,于下腔靜脈處,抽取2 ml靜脈血,離心后分離血清,置于-80 ℃冰箱中凍存,備用。

將小鼠耳蝸及前庭組織切除后,置液氮中10 min,勻漿機(jī)低速勻漿3 min,冰浴1 min,重復(fù)操作至組織完全裂解,冷凝處理后,以2 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min,取上清液于-80 ℃的冰箱中凍存。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 ABR聽力測試 用藥前及停藥后,在隔音、屏蔽的房間內(nèi),用YJC-A誘發(fā)電位儀測量清醒小鼠的聽覺腦干反應(yīng)[10]。將小鼠固定,引導(dǎo)電極放置在頭骨的頂部,參考電極和接地電極分別置于同側(cè)和對側(cè)乳突上,并用短聲刺激。聲音刺激器輸入波幅為0.1 ms的方波電脈沖,并通過耳機(jī)輸出,10次/s。以Ⅳ波剛出現(xiàn)時的刺激強(qiáng)度dB值為聽覺腦干反應(yīng)(ABR)的閾值。

1.3.2 ELISA法測定蛋白表達(dá) 采用ELISA法進(jìn)行檢測血清中TNF-α、IL-6和IL-17的表達(dá),嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行。利用ELISA酶標(biāo)儀(ELX800)450 nm波長讀取每孔吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)曲線計算OD值和各項指標(biāo)的血清含量。

1.3.3 免疫組織化學(xué)檢測蛋白陽性率 采用免疫組織化學(xué)技術(shù)進(jìn)行檢測。取耳蝸組織制作石蠟切片,切取厚度為3 μm,按照所設(shè)定好的實驗步驟進(jìn)行嚴(yán)格操作。DAB、IL-6和IL-17的一抗、二抗以及TNF-α均購自上海安妍生物有限公司。使用光學(xué)顯微鏡對相應(yīng)的染色結(jié)果進(jìn)行觀察以及拍攝。如細(xì)胞顏色呈現(xiàn)棕黃色,則屬于陽性結(jié)果。隨機(jī)抽取3個上皮細(xì)胞分布區(qū),分別對著色強(qiáng)度以及陽性率作出客觀評分。陽性率<25%,25%-50%,51%-75%,>75%分別對應(yīng)1分,2分,3分,4分。著色強(qiáng)度無明顯著色、淺黃色、棕黃色、黃褐色分別對應(yīng)著0分,1分,2分,3分。兩者得分之和≤2分者為陰性,>2分者為陽性,計算陽性率。

采用實時熒光定量PCR法進(jìn)行檢測。引物由上海云序生物科技有限公司合成(見表1),相關(guān)試劑產(chǎn)自美國ABP Biosciences公司。嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。反應(yīng)體系:94 ℃ 5 min,循環(huán)1次;94 ℃ 25 s,64 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,循環(huán)15次;93 ℃ 25 s,60 ℃35 s,72 ℃ 20 s,反復(fù)35次。在60 ℃完成對信號的有效收集以及對相應(yīng)Ct值的有效讀取,通過2-ΔΔCt法計算目的基因相對水平。

表1 引物信息

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ABR閾值比較

干預(yù)前模型組和空白對照組間ABR閾值具有顯著性差異(P<0.05),說明造模成功。使用EPO進(jìn)行干預(yù)后,EPO組ABR閾值較干預(yù)前明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而生理鹽水組在EPO干預(yù)前后ABR閾值無明顯差異。EPO組干預(yù)后的閾值明顯低于生理鹽水組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表2)。

2.2 各組血清中TNF-α、IL-6和IL-17表達(dá)比較

ELISA結(jié)果顯示:模型組血清中IL-6、IL-17以及TNF-α含量明顯高于空白對照組(P<0.05);生理鹽水組與模型組間血清中IL-6、IL-17以及TNF-α含量無明顯差異(P>0.05);與生理鹽水組比較,EPO組血清中IL-6、IL-17以及TNF-α含量顯著降低(P<0.05,見表3)。

表2 各組小鼠ABR閾值變化 (dB SPL)

2.3 各組耳蝸組織中TNF-α、IL-6和IL-17表達(dá)陽性率比較

免疫組化結(jié)果顯示:模型組IL-6、IL-17以及TNF-α陽性率明顯高于空白對照組(P<0.05);生理鹽水組與模型組間IL-6、IL-17以及TNF-α陽性率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與生理鹽水組比較,EPO組耳蝸組織中IL-6、IL-17以及TNF-α的陽性率顯著降低(P<0.05,見表4)。

2.4 各組耳蝸組織中TNF-α mRNA、IL-6 mRNA和IL-17 mRNA表達(dá)比較

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示:模型組耳蝸組織中TNF-α mRNA、IL-6 mRNA和IL-17 mRNA表達(dá)明顯高于空白對照組(P<0.05);生理鹽水組耳蝸組織中TNF-α mRNA、IL-6 mRNA和IL-17 mRNA的相對表達(dá)與模型組比較,無顯著差異(P>0.05);與生理鹽水組比較,EPO組耳蝸組織中TNF-α mRNA、IL-6 mRNA和IL-17 mRNA的相對表達(dá)顯著降低(P<0.05,見表5)。

表5 耳蝸組織中TNF-α mRNA、IL-6 mRNA和IL-17 mRNA表達(dá)比較

3 討論

老年性耳聾主要與內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)定性的下降以及生物體器官、組織和細(xì)胞的功能和結(jié)構(gòu)隨著年齡的增長而退化有關(guān),有研究表明炎癥可能是老年性耳聾病理改變的重要機(jī)制[11,12]。健康動物或者健康老年人的血清當(dāng)中存在著包括TNF-α以及IL-6在內(nèi)的高水平促炎性細(xì)胞因子[13]。多項實驗數(shù)據(jù)表明TNF-α以及IL-6促炎性細(xì)胞因子與多種年齡相關(guān)性疾病之間存在著非常密切的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示,EPO組與生理鹽水組相比,TNF-αIL-6和IL-17的mRNA表達(dá)量明顯降低。這說明EPO干預(yù)能夠使得老年性聾小鼠模型相應(yīng)的耳蝸組織以及血清中IL-6和IL-17以及TNF-α的正常表達(dá)受到抑制,從而實現(xiàn)對局部炎癥反應(yīng)的有效預(yù)防和緩解。分析原因可能是老年性聾小鼠相應(yīng)的耳蝸組織以及血清中IL-6和IL-17以及TNF-α的含量及表達(dá)水平都比正常小鼠超出很多,這些因子的高表達(dá)可能代表著局部炎癥損傷[14-17]。在受到EPO的干預(yù)之后,相對應(yīng)的表達(dá)水平會出現(xiàn)明顯下降,表明其能有效減弱局部炎癥反應(yīng)[18-21]。有研究結(jié)果證實,由噪音導(dǎo)致的耳聾患者或者由于免疫介導(dǎo)而導(dǎo)致的內(nèi)耳疾病患者的耳蝸組織中,包括IL-10以及IL-6和TNF-α在內(nèi)的各種促炎細(xì)胞因子與正常人相比明顯高表達(dá)[22]。這些結(jié)果進(jìn)一步證實了促炎細(xì)胞因子與耳聾具有密切的聯(lián)系。

近年來,研究成果已證實了EPO能夠有效抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡,促進(jìn)血管生成,同時還具有比較強(qiáng)大的神經(jīng)保護(hù)功能[23,24]。另外還有部分研究證實EPO能夠使得線粒體的穩(wěn)定狀態(tài)得以保持,從而減少局部細(xì)胞的凋亡[25]。本文實驗結(jié)果也顯示EPO對TNF-α、IL-6和IL-17的表達(dá)有明顯的下調(diào)作用,這表明EPO可能有效抑制了炎癥反應(yīng)。但目前對IL-6和IL-17以及TNF-α在小鼠耳蝸組織當(dāng)中復(fù)雜的作用機(jī)制還沒有足夠清晰的研究與闡明,需要本課題組后續(xù)進(jìn)一步的研究。