李子財 陽燕 陳發(fā)平

摘要：疏水層析是根據(jù)分子表面疏水性差別來分離蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的一種較為常用的方法。不同的分子由于疏水性不同，它們與疏水性層析介質(zhì)之間的疏水性作用力強弱不同，因此可以用來分離純化目的蛋白，去除聚體、HCP、rProteinA等雜質(zhì)[1]。

關(guān)鍵詞：疏水層析，疏水層析填料，SEC-HPLC純度，HCP，得率

【中圖分類號】R-3 【文獻標識碼】A 【文章編號】1673-9026（2021）04-008-01

一.背景介紹

疏水層析填料配基疏水性由弱到強的順序為：乙醚（Ether），聚丙二醇（PPG），苯基（Phenyl），丁基（Butyl），己基（Hexyl）[2]。Hexyl和Butyl常用來分離低疏水性的蛋白。實驗中選取了不同廠家的三種疏水層析填料，其中廠家不同的Phenyl BeStaroSe 6 FaSt Flow填料和TOYOPEARL Phenyl-600M填料都是交聯(lián)瓊脂糖為支持物，交聯(lián)瓊脂糖支持物與苯基（Phenyl）共價結(jié)合。TOYOPEARL Butyl-600M填料的疏水基團為丁基（Butyl）。

疏水層析緩沖液體系中高離子強度可以增強蛋白質(zhì)與疏水性層析介質(zhì)之間的疏水作用。利用這個性質(zhì)，在高離子強度下將待分離的目的蛋白吸附在疏水性層析介質(zhì)上，大部分親水性的雜質(zhì)在上樣和平衡的過程中流穿，然后通過線性洗脫的方式，降低離子強度，選擇性的將目的蛋白洗脫下來。疏水性弱的物質(zhì)，在較高離子強度的溶液時被洗脫下來，當(dāng)離子強度降低時，疏水性強的物質(zhì)才隨后被洗脫下來，從而得到分離去除雜質(zhì)的效果[3]。

二.實驗方法

1.實驗材料

層析柱：MilliPoreVL11×250mm

層析填料：Phenyl BeStaroSe 6 FF、TOYOPEARL Butyl-600M、TOYOPEARL Phenyl-600M

層析系統(tǒng)：GE AKTAPurifier 100

蛋白樣品：來自于CHO細胞培養(yǎng)產(chǎn)物純化中間體

①陰離子交換層析濃縮后樣品

②陰離子交換層析后樣品

2.實驗步驟：

（1） 考察樣品在不同濃度硫酸銨的穩(wěn)定性，摸索實驗最佳緩沖液條件

將樣品①與3 M硫酸銨、0.25 M 磷酸鹽緩沖液（PH6.8）、純化水相互混合，分別配制成濃度為0.5至1.0 M的硫酸銨溶液，每管體積為10 mL。觀察樣品在不同硫酸銨濃度下的澄清狀態(tài)，是否析出。

（2） 考察不同疏水填料對雜質(zhì)的去除效果和得率，選擇合適的疏水填料。

選取三種疏水層析填料進行對比實驗。平衡液為0.7 M硫酸銨25 mM 磷酸鹽緩沖液（PH6.2±0.2），將樣品②以10%乙酸和3 M硫酸銨調(diào)節(jié)至PH6.2±0.2電導(dǎo)率100±15 mS/cm。三種填料分別裝成I.D.1.1×20 cm（20 mL）規(guī)格的層析柱，上樣載量為20 mg/mL，流速為180cm/h，0-100% 10個柱體積線性梯度洗脫。從洗脫峰UV吸收值>300 mAU（UV280nm）開始收集，至UV吸收值<300 mAU（UV280nm）時結(jié)束收集。樣品送檢SEC-HPLC純度、HCP。

三.實驗結(jié)果

1.樣品在不同濃度硫酸銨中的穩(wěn)定性

實驗結(jié)果見表1。根據(jù)數(shù)據(jù)，初步計劃后期疏水層析實驗使用的上樣樣品及平衡液的硫酸銨濃度上限為0.7M，PH范圍為6.0-6.4。

2.不同疏水填料對雜質(zhì)的去除效果比較

從三種填料的層析圖譜峰型能看出三種填料均能很好的和目的蛋白結(jié)合，在合適的洗脫條件下能成功的將目的蛋白洗脫下來。由表2可見，上樣樣品蛋白本身純度較高，經(jīng)過上樣樣品PH和電導(dǎo)調(diào)節(jié)，以及疏水層析后蛋白純度沒有降低，說明此工藝對蛋白純度無影響。綜合考慮得率、HCP的去除效果，最終選用TOYOPEARL Butyl-600M填料作為該目的蛋白的疏水層析填料。

四.結(jié)論

三種疏水層析填料均有較好的去除HCP的效果，綜合得率和HCP去除效果，最終選擇疏水基團為丁基（Butyl）的TOYOPEARL Butyl-600M填料作為目的蛋白的疏水層析填料。

五.參考文獻

[1]《生物化學(xué)》王鏡巖

[2]疏水相互作用填料 TOSOH BioScience

[3]俞俊棠等.新編生物工藝學(xué) （下冊）：化學(xué)工業(yè)出版社，2003年06月第1版

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