陳南輝, 鐘偉楓, 潘斌, 王曉紅, 黃志成, 江惠明, 譚萬龍

(1.南方醫(yī)科大學(xué) 南方醫(yī)院 泌尿外科， 廣東 廣州 510515； 2.梅州市人民醫(yī)院 泌尿外科， 廣東 梅州 514031；3.暨南大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 泌尿外科， 廣東 廣州 510632； 4.南方醫(yī)科大學(xué) 第三附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科， 廣東 廣州 510515)

前列腺癌(prostate cancer, PCa)是男性常見的惡性腫瘤之一，PCa發(fā)病率在我國逐年增高，其死亡率也隨著年齡增長而上升[1].其發(fā)病起病隱匿、大多數(shù)患者確診時已到晚期，目前臨床治療以手術(shù)及雄激素阻斷為主，但激素依賴性PCa治療大部分會發(fā)展成為去勢抵抗性PCa，進(jìn)一步增加治療難度[2].由于PCa發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制尚未完全闡明，對于晚期PCa尚未有有效治療手段[3-4].因此探討PCa的發(fā)病機(jī)制，探索PCa的早期診斷標(biāo)記物，對于PCa的預(yù)防和前期診治具有重要的意義.

單酰甘油酯酶(monoacylglycerol lipase, MGLL)是一種催化單酰基甘油轉(zhuǎn)化為游離脂肪酸(FFA)和甘油的脂解酶，與脂質(zhì)代謝相關(guān)[5].MGLL在動脈硬化、缺血再灌注損傷等疾病模型中發(fā)揮重要作用，如水解內(nèi)源性大麻素2-花生四烯酰甘油[6-7].有研究表明，MGLL被證實參與多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的調(diào)控，比如黑色素瘤[8]、乳腺癌[9]、肝癌[10]和結(jié)直腸癌[11].然而目前MGLL在PCa中的作用尚未明確，亟待研究分析.本研究利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)挖掘的方法，分析MGLL在癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas, TCGA)和Oncomine等癌癥公共數(shù)據(jù)庫中PCa中的表達(dá)情況及其對PCa病人的臨床預(yù)后，而后通過Western blot及Transwell等實驗在前列腺細(xì)胞癌系中對其功能進(jìn)行驗證.

1 材料和方法

1.1 Oncomine數(shù)據(jù)挖掘

Oncomine(https://www.oncomine.org)數(shù)據(jù)庫是一個基于已發(fā)表文獻(xiàn)的基因芯片收集數(shù)據(jù)庫和集成數(shù)據(jù)挖掘平臺，可根據(jù)自己的需求設(shè)定數(shù)據(jù)集篩選條件，本研究設(shè)定的條件為：(1)Cancer Type: Prostate cancer；(2)Gene：MGLL；(3)Data Type：mRNA；(4)Analysis Type：Cancer vs. Normal Analysis；(5)條件：P<0.05, fold change>2, rank=top 20%.

1.2 TCGA數(shù)據(jù)挖掘

通過基因表達(dá)譜交互分析(gene expression profiling interactive analysis,GEPIA)工具對TCGA中PCa的MGLL基因表達(dá)進(jìn)行分析，包括：PCa組織差異表達(dá)、患者生存分析和相似基因檢測.篩選設(shè)定條件為：(1)表達(dá)模塊.選擇MGLL及Match TCGA normal data；(2)生存分析模塊.Survival Plots(生存圖表)選擇MGLL，Overall Survival (總體生存率)或者 Disease Free Survival(無病生存率)；(3)Correlation 相關(guān)性模塊.MGLL與FGFR1、PIK3CA、AKT2和GSK3B.

1.3 MGLL蛋白水平分析

人類蛋白質(zhì)圖譜(the human protein atlas,THPA)在線工具(https://www.proteinatlas.org)通過整合人體不同組織器官的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，收集展示了多種正常及癌組織的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果.本研究檢索MGLL在PCa及正常組織中的免疫組織化學(xué)染色情況.

1.4 MGLL基因克隆及過表達(dá)

在Genebank上搜索人MGLL基因序列(NM_007283.1)，設(shè)計并合成目的基因引物，并將MGLL克隆與pEGFP-C1質(zhì)粒，最終經(jīng)測序肯定該質(zhì)粒構(gòu)建成功.而后該基因過表達(dá)與人PCa細(xì)胞系DU145細(xì)胞，采用Western blot 方法檢測GFP-MGLL蛋白的表達(dá)水平.采用Lipofectamine 2000 (Promega)對PCa細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，觀察細(xì)胞遷移和侵襲情況.

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與Transwell細(xì)胞遷移和侵襲

人PCa細(xì)胞系PC3及DU145細(xì)胞由暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實驗室提供.細(xì)胞于RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，細(xì)胞融合至90%，采用Lipofectamine 2000 試劑盒轉(zhuǎn)染GFP-MGLL及GFP空載體.細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞，用100 μL無血清重懸轉(zhuǎn)入Transwell小室，進(jìn)行遷移和侵襲(鋪Matrigel膠)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h后取出小室，體積分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌1次，結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗滌干凈，于顯微鏡下觀察細(xì)胞是否穿透小孔，并拍照記錄，200倍光鏡選取5個視野記錄穿膜細(xì)胞個數(shù)，實驗重復(fù)3次.

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Rstudio 1.2.5033對篩選數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩組間比較MGLL的表達(dá)差異采用t檢驗.全部采用在線工具分析的P值結(jié)果.生存分析為Kaplan-Meier生存分析及l(fā)og-rank檢驗.MGLL與信號通路相關(guān)蛋白的共表達(dá)相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析.

2 結(jié)果

2.1 MGLL mRNA水平在正常及PCa組織間的表達(dá)差異

Oncomine數(shù)據(jù)庫共檢索到6個包含MGLLmRNA表達(dá)差異的隊列研究，Meta分析提示，MGLL基因在PCa樣本中顯著低表達(dá)(P=0.021，圖1).圖2進(jìn)一步展示了每個隊列研究中MGLLmRNA的表達(dá)水平在PCa和正常組織中的表達(dá)情況，顯示MGLLmRNA水平均顯著下調(diào)(6個隊列數(shù)據(jù)分別如下：t=-3.547,P<0.001;t=-1.178,P=0.014;t=-2.822,P=0.003;t=-2.801,P=0.005;t=-1.977,P=0.029;t=-2.337,P=0.013).

為進(jìn)一步肯定MGLL 蛋白表達(dá)水平的差異，本研究通過THPA在線工具搜索并分析了MGLL在正常及PCa組織中的蛋白表達(dá)水平.結(jié)果表明，MGLL蛋白主要分布在細(xì)胞胞漿部分，在正常前列腺組織中高表達(dá)，而在癌組織中低表達(dá)或不表達(dá)(圖3)，與其mRNA結(jié)果趨勢一致.

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中基于GEO數(shù)據(jù)的Meta分析結(jié)果

A: Grasso prostate 研究(GSE35988)；B: Liu prostate研究(E-TABM-26)；C: Taylor prostate 3 研究(GSE21034)；D: Vanaja prostate研究(PMID: 12873976)；E: Welsh prostate研究(PMID: 11507037)；F: Yu prostate 研究(GSE6919).

A:前列腺正常組織，來源于THPA網(wǎng)站(Patient id：2053).B:PCa組織，來源于THPA網(wǎng)站(Patient id：2828).

2.2 MGLL表達(dá)與PCa預(yù)后的相關(guān)性

GEPIA在線工具分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中的52例正常前列腺組織及492例PCa組織.圖4A所示MGLL的mRNA水平同樣在PCa組織中顯著下調(diào)(P<0.001).進(jìn)一步分析了MGLLmRNA水平與PCa患者總生存期(overall survival，OS)及無病生存期(diseasefree survival,DS)的關(guān)系，按50%中位數(shù)樣本進(jìn)行截斷分為MGLL高表達(dá)和低表達(dá)組.如圖4B和C所示，MGLL表達(dá)水平對患者的OS及DFS均存在顯著影響.與高表達(dá)組相比，MGLL低表達(dá)的PCa患者中位OS和DFS均顯著縮短(P=0.018;P=0.934).

2.3 MGLL與FGF/PI3K/AKT信號通路關(guān)鍵分子在PCa中表達(dá)的相關(guān)性

因目前MGLL與PCa發(fā)生發(fā)展的機(jī)制不清，為探索MGLL基因在PCa中發(fā)揮作用的分子機(jī)制，本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析了MGLL與成纖維細(xì)胞生長因子受體FGFR1、PI3K/AKT信號通路關(guān)鍵分子如AKT2、GSK3B、脂酰肌醇3-激酶催化亞基 α (PIK3CA)在PCa族中的表達(dá)相關(guān)性，Pearson 相關(guān)性分析顯示，MGLL與FGFR1、PIK3CA、AKT2、GSK3B的表達(dá)均呈正相關(guān)(R=0.6,P=0;R=0.36,P=0;R=0.22,P<0.001;R=0.36,P=0;R=0.5,P=0，圖5).

2.4 MGLL 在PCa細(xì)胞系中的表達(dá)及其對細(xì)胞遷移和侵襲的影響

前面的分析表明MGLL可能是個抑癌因子，為進(jìn)一步證實，本小組通過實驗觀察了MGLL在PCa細(xì)胞系中的表達(dá)情況.如圖6A、B所示，RWPE-1是人正常前列腺上皮細(xì)胞，為對照細(xì)胞系；LNCap、DU145、PC3均為PCa細(xì)胞系.Western blot檢測表明，MGLL在多個PCa細(xì)胞系中低表達(dá)(P<0.05).進(jìn)一步構(gòu)建了用于過表達(dá)的GFP-MGLL質(zhì)粒，在DU145細(xì)胞中肯定了該質(zhì)粒的表達(dá)情況(圖6C).將該質(zhì)粒于DU145及PC3細(xì)胞中過表達(dá)，而后通過Transwell實驗觀察MGLL對細(xì)胞系遷移和侵襲能力的影響.結(jié)果表明過表達(dá)MGLL之后，PCa細(xì)胞系的遷移(圖6D)和侵襲(圖6E)能力顯著減弱(P<0.05)，說明MGLL在PCa細(xì)胞系中低表達(dá)，上調(diào)MGLL水平可抑制PCa遷移和侵襲，MGLL為抑癌因子.

A: GEPIA中MGLL mRNA在TCGA數(shù)據(jù)庫的表達(dá)情況；B: 總生存曲線；C: 無瘤生存曲線.

A: FGFR1與MGLL表達(dá)相關(guān)性；B: PIK3CA與MGLL表達(dá)相關(guān)性；C: AKT2與MGLL表達(dá)相關(guān)性；D: GSK3B與MGLL表達(dá)相關(guān)性.

A：Western blot檢測MGLL在PCa細(xì)胞系中的表達(dá)水平；B：表達(dá)水平的量化結(jié)果；C：Western blot檢測GFP-MGLL在DU145細(xì)胞系中過表達(dá)情況；D，E：DU145和PC3細(xì)胞系中檢測過表達(dá)MGLL對細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響. 1)P<0.01

3 討論

近期研究表明，代謝(尤其是脂代謝)與腫瘤的關(guān)系相當(dāng)密切.MGLL又被稱為甘油一脂酶，是一類絲氨酸水解酶[12].MGLL在脂肪組織、卵巢及睪丸中表達(dá)，其協(xié)同激素敏感性脂解酶將三酰甘油分解為脂肪酸及甘油，為細(xì)胞提供能量[13].最近文獻(xiàn)指出，MGLL除了在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用之外，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮了重要作用.然而MGLL在不同腫瘤中的作用有差異，在有些腫瘤中是抑癌因子，有些腫瘤中是促癌因子.Nomura等[9]的研究首次提出了MGLL在一些侵襲性及原發(fā)性腫瘤中高表達(dá)，比如黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌等，通過脂肪酸能量代謝途徑促進(jìn)腫瘤的生長轉(zhuǎn)移.Joyce等[14]在結(jié)直腸癌研究中發(fā)現(xiàn)MGLL與EMT的信號分子表達(dá)有相關(guān)性，懷疑MGLL促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移可能是通過EMT進(jìn)行.Ye等[15]的研究顯示在結(jié)直腸癌細(xì)胞中敲低MGLL，可以抑制BCL-2和Cyclin D1的表達(dá)，從而抑制癌細(xì)胞生長誘導(dǎo)凋亡.但Sun等[11]的研究得出相反結(jié)果，結(jié)直腸癌中過表達(dá)MGLL可通過PI3K/AKT通路抑制腫瘤的生長.MGLL在PCa發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入闡明.Nomura等[16]比較了雄性激素依賴和非依賴的人PCa細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)MGLL通過大麻素抑制通路和脂肪素促進(jìn)通路，一正一反共同調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長遷移.本研究通過現(xiàn)有的公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行挖掘，對MGLL基因在PCa樣本中的表達(dá)進(jìn)行分析，且通過試驗驗證了MGLL在PCa中的抑癌作用.

本研究分析了公共數(shù)據(jù)庫前列腺正常及癌組織中MGLLmRNA和蛋白表達(dá)情況，探討了其表達(dá)水平與臨床預(yù)后的關(guān)系.TCGA和GEO的數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，與正常前列腺組織相比，MGLLmRNA水平在PCa中呈低表達(dá).通過THPA發(fā)現(xiàn)MGLL蛋白水平在PCa中同樣低表達(dá)，與轉(zhuǎn)錄水平的分析結(jié)果一致.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MGLL的mRNA水平與患者的OS和DFS均存在顯著相關(guān)性，MGLL高表達(dá)的PCa患者其OS和DFS顯著提高.蛋白共表達(dá)相關(guān)性分析表明，MGLL與FGF/PI3K/AKT信號通路密切相關(guān).TCGA數(shù)據(jù)庫的表達(dá)分析表明，MGLL與該通路的關(guān)鍵分子(FGGR1、PIK3CA、AKT2、GSK3B)呈正相關(guān).深入觀察了PCa細(xì)胞系中MGLL的水平，發(fā)現(xiàn)MGLL低表達(dá)；而過表達(dá)MGLL則可顯著抑制PCa細(xì)胞系的遷移和侵襲能力.綜上MGLL是個抑制腫瘤的蛋白，且其發(fā)揮功能可能與PI3K/AKT信號通路相關(guān)，這為進(jìn)一步驗證MGLL參與PCa脂質(zhì)代謝的分子機(jī)制提供了新的證據(jù).

綜上，本研究通過對前列腺及癌組織中MGLL的深入挖掘與分析，發(fā)現(xiàn)MGLL在PCa樣本中低表達(dá)，并與腫瘤患者預(yù)后相關(guān).數(shù)據(jù)庫大樣本分析可避免研究樣本量過小而造成的誤差，為PCa的基礎(chǔ)研究提供了一定的理論依據(jù)和新的思路.