薛蓮芳, 劉慧, 丘穗珊, 朱勤愛, 王玉平, 羅惠娟

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1.藥學(xué)部, 2.臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心, 3.產(chǎn)科， 廣東 廣州 510630)

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)是妊娠期常見的嚴(yán)重并發(fā)癥.臨床表現(xiàn)為孕婦血清膽汁酸濃度顯著增加，伴或不伴轉(zhuǎn)氨酶、膽紅素升高[1-2].病因?qū)W研究發(fā)現(xiàn)該病與遺傳和雌激素過高有關(guān)，可導(dǎo)致早產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)窘迫和胎死宮內(nèi)等.目前常用的治療有腺苷蛋氨酸和熊去氧膽酸，還可以輔助一些利膽退黃的中藥，但仍有一部分患者治療效果不好，需要提前終止妊娠或發(fā)生嚴(yán)重胎兒、新生兒并發(fā)癥.

穿心蓮[Andrographispaniculata(Burm. F.)Nees]為爵床科植物，別名一見喜、斬蛇草及苦膽草等[3].其原產(chǎn)于印度半島和斯里蘭卡，在東南亞國家具有悠久的民間用藥歷史，是最具代表性的“大南藥”之一[4].穿心蓮性味苦寒，有抗菌消炎、清熱解毒及消腫止痛等功效，是清火梔子麥片、消炎利膽片、穿心蓮內(nèi)酯片及蓮必治注射液等多種中藥制劑的主要原料，可用于呼吸道感染、腸胃炎、高血壓、瘧疾、毒蛇咬傷、糖尿病及高血壓等疾病的臨床治療，有“中藥抗生素”之稱[5-6].穿心蓮主要藥用成分為烷型二萜類化合物，如穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide，AD)、新穿心蓮內(nèi)酯(neoandrographolide，NAD)、14-脫氧穿心蓮內(nèi)酯(14-deoxyandrographolide，14DAP)及脫水穿心蓮內(nèi)酯(dehydroandrographolide，DDAD)等[7].

本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法首次對穿心蓮治療ICP的分子機(jī)制進(jìn)行了全面系統(tǒng)的解析，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法可通過整合多種生物數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建“成分-疾病-靶點(diǎn)-通路”的互作網(wǎng)絡(luò)，探究中藥成分對于疾病的主要分子作用機(jī)制與信號通路，是目前探索中藥方劑藥理機(jī)制的綜合有效的方法.另外，本研究通過建立ICP大鼠動物模型，給予模型鼠AD治療，觀察AD對ICP的治療效果，進(jìn)一步闡述穿心蓮治療ICP的分子機(jī)制，探究其對關(guān)鍵靶點(diǎn)的作用，為臨床藥物的開發(fā)和臨床應(yīng)用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 穿心蓮化學(xué)成分及其靶點(diǎn)的預(yù)測

以“穿心蓮”為關(guān)鍵詞，通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)進(jìn)行檢索，得到穿心蓮的主要化學(xué)成分.根據(jù)藥物篩選中最常用的兩種藥代動力學(xué)特性進(jìn)行篩選：口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug-like，DL)≥0.18，從而獲得穿心蓮中具有較高活性的潛在有效化學(xué)成分.

1.2 靶點(diǎn)的篩選

GeneCards (https://www.genecards.org/)是一個集成大量web源的以基因?yàn)橹行牡臄?shù)據(jù)庫，能解釋并預(yù)測人類基因信息.以妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥“Intrahepatic cholestasis of pregnancy”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫查找疾病相關(guān)靶點(diǎn).通過Comparative Toxicogenomics Database(http://ctd.mdibl.org/)數(shù)據(jù)庫中MyVeny功能，繪制穿心蓮成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)匹配映射的韋恩圖，獲得穿心蓮治療ICP的潛在靶點(diǎn).

1.3 PPI圖制作

將藥物作用靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的交集輸入到STRING數(shù)據(jù)庫，種屬選擇“Homo sapiens”，獲取公共靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(PPI)，并進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，導(dǎo)出string.interactions.tsv文件.

1.4 功能和通路富集分析

利用Bioconductor平臺和R語言對獲得的基因進(jìn)行基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析.首先進(jìn)行R 語言安裝包的安裝，包括DOSE，clusterProfiler，enrichplot，colorspace，stringi，ggplot2，pathview軟件包，分別導(dǎo)出GO 功能富集分析和KEGG通路富集分析表格，將分析結(jié)果的前20 條進(jìn)行可視化.

1.5 試劑與儀器

SD大鼠購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[許可證號：SYXK(粵)2017-0125]；苯甲酸雌二醇(批號K1617016)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；大豆油(批號D1515001)購自aladdin公司(批號D1515001)；氯化鈉注射液(批號1907172727)購自辰欣藥業(yè)有限公司；促凝管(批號190309)購自瀏陽市三力醫(yī)藥科技有限公司，離心機(jī)(TDL- 40B)購自上海安亭科學(xué)儀器廠(TDL- 40B)，全自動生化分析儀(型號7600)購自日立公司.

1.6 動物實(shí)驗(yàn)

SD大鼠雌性70只，雄性35只，體質(zhì)量(220.3±13.5)g,自由飲水與飼料，發(fā)情期雌性和雄性大鼠按2∶1合籠.交配后以陰道拭子見精子即妊娠第0天為標(biāo)準(zhǔn)判斷妊娠成功，選取其中50只成功受孕雌鼠實(shí)驗(yàn).妊娠后第10天，隨機(jī)將50只雌鼠分5組(空白組，模型對照組和高、中、低劑量治療組)，每組10只.根據(jù)文獻(xiàn)[8]對模型對照組和治療組進(jìn)行造模.常規(guī)喂養(yǎng)至妊娠第10天，除空白對照組外，其他各組自大鼠頸背部皮下注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)3 mg/kg苯甲酸雌二醇. 取適量穿心蓮內(nèi)脂溶解于大豆油中配置質(zhì)量濃度5 mg/mL的備用藥液，治療組大鼠按照體質(zhì)量計算給藥體積后每天分別灌胃穿心蓮內(nèi)脂溶液(高劑量組80 mg/kg，中劑量組40 mg/kg，低劑量組20 mg/kg).模型組灌胃氯化鈉注射液2 mL；妊娠第17天，大鼠乙醚麻醉，腹主動脈取血3～5 mL，置于促凝管中，3 000 r/min離心10 min，取上清液，交檢驗(yàn)科測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)，谷草轉(zhuǎn)氨酶谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，總膽汁酸(TBA)，膽紅素(TBIL)水平[1-2].孕鼠取血后，取胎，記錄活胎鼠數(shù)，死胎數(shù)量，胎鼠體質(zhì)量.

2 結(jié)果

2.1 穿心蓮候選化合物及靶點(diǎn)篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中，檢索中藥“穿心蓮”得到化學(xué)成分49個，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18 為條件，篩選出穿心蓮潛在活性化合物24個，主要包括穿心蓮黃酮、穿心蓮內(nèi)酯、漢黃芩素和穿心蓮黃酮甙 F、14-去氧-12-甲氧基穿心蓮內(nèi)酯等組分(表1)，共預(yù)測靶標(biāo)65個.

表1 穿心蓮的活性成分及參數(shù)Table 1 The active ingredients of Andrographis paniculata

2.2 藥物與疾病相交的靶點(diǎn)

通過Gene Cards數(shù)據(jù)庫共檢索出984個疾病相關(guān)靶點(diǎn).將穿心蓮潛在作用靶點(diǎn)映射到獲得的疾病相關(guān)靶點(diǎn)中，共獲得30個相交靶點(diǎn)，制成韋恩圖(圖1).從側(cè)面佐證了穿心蓮治療該疾病的科學(xué)性和有效性.

2.3 “藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建及分析

將穿心蓮的24個活性成分與30個藥物-疾病共同靶點(diǎn)輸入Cytoscape 3.7.1 軟件中，構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(圖2).結(jié)果涉及21個成分(3個活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)無交集，故刪除)和30個藥物-疾病共同靶點(diǎn)，充分體現(xiàn)了穿心蓮多成分、多靶點(diǎn)治療ICP的作用.

圖1 韋恩圖

圖2 有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將30個靶蛋白輸入到STRING數(shù)據(jù)庫獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖3).該網(wǎng)絡(luò)共有30個節(jié)點(diǎn)，共185個相互作用關(guān)系線，平均度值為12.3.

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 靶點(diǎn)功能及通路富集分析

基于穿心蓮治療ICP交集網(wǎng)絡(luò)共篩選到30個靶點(diǎn)基因進(jìn)行富集分析，根據(jù)P值，排前20的顯著富集GO 功能和KEGG 代謝通路如圖4.其中GO 富集分析涉及生物學(xué)過程(biological process)、分子功能(molecularfunction) 和細(xì)胞組成(cellular component) 等3個水平.共同作用靶點(diǎn)在生物過程(BP)中，主要富集條目多為對類固醇激素的反應(yīng)、DNA模板化的轉(zhuǎn)錄起始、氧化應(yīng)激反應(yīng)(圖4).共同作用的靶點(diǎn)在細(xì)胞組成(CC)中主要富集條目為周期蛋白依賴蛋白激酶全酶復(fù)合物、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物、蛋白激酶復(fù)雜(圖5).共同靶點(diǎn)在分子功能(MF)中主要富集的條目為類固醇激素受體活性、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子的活性, 泛素蛋白連接酶結(jié)合(圖6).KEGG 富集分析結(jié)果顯示如圖7所示，共同靶點(diǎn)主要富集于PI3K-Akt信號通路、小細(xì)胞肺癌通路、乙型肝炎通路.

圖4 生物學(xué)過程圖

2.6 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.6.1 各組孕鼠體內(nèi)血液生化指標(biāo)比較

血清標(biāo)本經(jīng)血液生化分析儀檢測TBIL，ALT，AST，TBA值見表2.與空白對照組比較，其他各組生化指標(biāo)均顯著增高(P<0.05)，顯示苯甲酸雌二醇造模效果好、成功率高.除低劑量組，其他各組與模型對照組比較各指標(biāo)均有顯著性差異(P<0.05)，中、高劑量治療組各項(xiàng)指標(biāo)與模型對照組比較均明顯下降(P<0.05)，高劑量組改善尤其明顯.

圖6 分子功能圖

圖7 KEGG圖

表2 各組孕鼠體內(nèi)血液生化指標(biāo)比較Table 2 Comparison of blood biochemical indexes in pregnant rats of each group

2.6.2 各組胎鼠數(shù)量與質(zhì)量比較

空白組胎鼠全部存活，無死胎，平均質(zhì)量最大，各項(xiàng)指標(biāo)均明顯優(yōu)于其他各組.低劑量組在各項(xiàng)指標(biāo)上與模型組均無顯著差異.觀察活胎鼠數(shù)，高劑量組比中、低、模型對照組均具有顯著提高，中劑量組在這個指標(biāo)上對比低、模型組又有明顯改善.觀察死胎數(shù)量，中、低、模型組3組間無顯著差異，高劑量組死胎數(shù)量明顯高于其他各組.觀察胎鼠平均質(zhì)量，高劑量組質(zhì)量明顯大于中、低、模型對照組，而中劑量組對比低、模型組又有明顯提高.

表3 各組胎鼠數(shù)量與質(zhì)量比較Table 3 Quantity and quality of fetal rats in each group were compared

3 討論

目前ICP的發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與多種因素有關(guān)，其中高激素水平是導(dǎo)致ICP發(fā)生的重要原因之一.研究顯示雌激素在ICP 的發(fā)病過程中風(fēng)險系數(shù)較高，起著重要的作用，ICP孕婦體內(nèi)的雌激素水平如果快速提升可引起肝細(xì)胞酶水平異常，這會降低膽鹽的代謝能力，從而誘發(fā)瘙癢、黃疸、尿酸高等癥狀[9-10].本次實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)使用苯甲酸雌二醇成功誘導(dǎo)孕鼠ICP發(fā)生，孕鼠體內(nèi)血液生化指標(biāo)均顯著高于空白對照組，顯示該造模效果明顯，成功率高.ICP治療常用的藥物有腺苷蛋氨酸和熊去氧膽酸[11]，可以輔助一些利膽退黃的中藥，但仍有一部分患者無效或病情反復(fù)，需要提前終止妊娠或發(fā)生胎兒、新生兒嚴(yán)重并發(fā)癥.

利用純天然植物或動物中提取的有效成分診治疾病，已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展熱點(diǎn).爵床科植物穿心蓮應(yīng)用于炎癥相關(guān)性疾病已有上百年歷史，明確、安全、有效的治療效果使其受到廣泛關(guān)注，隨著對穿心蓮的研究深入，它所顯現(xiàn)的廣泛的生理活性及防治心血管疾病、抗腫瘤、保肝利膽、增強(qiáng)免疫等多重功效, 使其成為一種很有前途的中藥, 值得進(jìn)一步研究和開發(fā).近十幾年的研究發(fā)現(xiàn)，AD對于重癥感染、酒精、有毒化合物導(dǎo)致的肝損傷均有明顯的治療作用[12-14].對膽汁淤積誘導(dǎo)肝纖維化具有保護(hù)作用[15]，AD可以有效地降低膽汁酸水平，增加實(shí)驗(yàn)大鼠、豚鼠的膽汁流量、膽鹽、膽酸和去氧膽酸量，改善肝功能[16]，與其他降膽酸的藥物不同的是，AD還有抗病毒的作用[17-18]，這對于大量合并乙肝病毒攜帶的ICP患者無疑是一個可能更好的選擇.

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高、中劑量治療組使用AD后對TBIL，ALT,AST,TBA值均有一定改善作用，且高劑量組對TBA值降低作用十分明顯，說明穿心蓮內(nèi)酯對ICP具有治療作用，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系.低劑量治療組對ICP未顯示明顯治療作用，說明本實(shí)驗(yàn)使用的高、中劑量組的穿心蓮內(nèi)酯雖對ICP有明顯療效，但未能完全消除ICP過程中TBA值的上升現(xiàn)象，可能需要增加藥量或延長療程.除TBA外，ALT， AST，TBIL 3個指標(biāo)也是ICP患者常見的異常指標(biāo)[19]，本研究中該3個生化指標(biāo)也根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件變化而發(fā)生相應(yīng)改變，模型組在苯甲酸雌二醇的刺激下3個指標(biāo)均大幅增長，但可以被高、中劑量AD緩解.穿心蓮內(nèi)脂對膽汁酸和肝功能的改善效果說明其對ICP具有一定的治療潛能.

ICP發(fā)生時會導(dǎo)致血清膽汁酸水平增加并通過胎盤運(yùn)輸?shù)教海瑢?dǎo)致胎兒受到嚴(yán)重?fù)p傷.此時因?yàn)樵袐D自身膽酸水平顯著升高，胎盤絨毛膜間隙受此作用會顯著縮小，導(dǎo)致流入胎盤中的血流量降低，影響胎盤正常血液灌注.再加上膽酸的血管收縮作用，所以圍產(chǎn)期胎兒很容易缺血缺氧，發(fā)生窘迫或死胎[20-21].本研究發(fā)現(xiàn)模型組胎鼠數(shù)量與體質(zhì)量均顯著低于空白對照組，說明胎鼠受到母體ICP影響，數(shù)量與體質(zhì)量均下降.給藥后發(fā)現(xiàn)高、中劑量治療組在胎鼠數(shù)量與質(zhì)量方面均有一定改善，且死胎數(shù)量也少于模型組與低劑量治療組，但與空白組比還有一定差距.說明實(shí)驗(yàn)劑量的AGL在一定程度上可以緩解ICP，但沒有完全改善不良預(yù)后.此外，雖然高劑量組在死胎數(shù)量上明顯高于其他各組，但活胎數(shù)也明顯多于模型對照組和中、低劑量治療組，因此高劑量治療組的胎兒死亡率(36.59%)仍然低于中劑量組(39.56%).

AD在妊娠期使用的安全性存在爭議，使它在臨床上的使用受到限制.既往報道，中藥穿心蓮具有明顯抗早孕效果.動物實(shí)驗(yàn)中顯示對不同妊娠期的小鼠都有明顯的終止妊娠作用，作用機(jī)理與抗孕酮抵抗有關(guān)，因此認(rèn)為外源性孕酮有明顯的防止穿心蓮早期流產(chǎn)的作用[22].有學(xué)者研究穿心蓮提取物對大鼠血孕酮水平的影響，在懷孕的第19天給予200、600和2 000 mg/kg的劑量，發(fā)現(xiàn)對大鼠血漿中孕酮水平的升高沒有任何影響.因此認(rèn)為在有效治療劑量下，穿心蓮提取物不會誘導(dǎo)孕酮介導(dǎo)的終止妊娠[23].研究還發(fā)現(xiàn)AD還能抑制子宮腺肌癥患者子宮肌層的催產(chǎn)素受體(OTR)的表達(dá)，從而抑制子宮收縮，達(dá)到止痛目的[24-25]，因此AD在晚孕期使用的安全性目前還沒有確定.本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型對照組死胎率最高，治療組死胎率都有不同程度的下降，尤其高劑量治療組，可見AD在孕晚期大鼠的使用并未增加死胎的發(fā)生，可能由于血清膽汁酸水平仍未恢復(fù)正常，所以還會導(dǎo)致一些胎鼠的死亡.

綜上所述，AD對ICP大鼠模型具有一定治療效果，對血液生化指標(biāo)有明顯改善作用，對胎鼠的數(shù)量和質(zhì)量均具有一定保護(hù)作用，值得進(jìn)一步研究，具有一定臨床應(yīng)用可能.