胡霞, 尹鵬, 劉忠, 黃嬌, 彭言劼, 范晶*

(1. 樂山師范學院 生命科學學院, 四川 樂山 614000； 2.中國科學院成都生物研究所 中國科學院山地生態(tài)恢復與生物資源利用重點實驗室， 四川 成都 610000)

土壤微生物是陸地生物地球化學循環(huán)的主要驅(qū)動者，直接參與土壤有機質(zhì)分解、轉(zhuǎn)化、積累和養(yǎng)分循環(huán)等關鍵生態(tài)過程，對生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力維持起著重要的作用[1-4].多年來，人們都主觀認為在氮循環(huán)過程中起著重要作用的微生物在寒冷的冬季處于睡眠狀態(tài)，然而在北極地區(qū)的研究表明，冷季的土壤仍然維持著微生物的活動，甚至土壤凍結的時候，北極地區(qū)的土壤中微生物活動仍然繼續(xù)[5].然而，微生物的數(shù)量和活動隨著溫度下降而快速減少[6].北極凍原地區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)，冬季微生物活性減少主要歸因于整個冬季碳供應不足導致的碳虧缺[7]. 而對于低緯度、高海拔、有機質(zhì)豐富、冬季土壤凍融交替變化頻繁的青藏高原東部地區(qū)是否存在碳虧缺有待進一步的探究.目前，國內(nèi)外關于外源碳輸入和凍融事件對土壤生態(tài)系統(tǒng)過程影響的報道很少，尤其缺乏在青藏高原地區(qū)冬季土壤微生物組成和功能的研究.

本文通過研究青藏高原東部高山草甸土壤微生物數(shù)量和活性對外源短期碳添加和凍融循環(huán)的響應機制，試圖回答“在有機質(zhì)豐富且凍融頻繁的青藏高原地區(qū)，碳限制是否影響微生物數(shù)量和活性”的科學問題，旨在多尺度多區(qū)域的了解高山土壤生態(tài)過程，并為進一步研究冬季高山土壤微生物菌群的轉(zhuǎn)化和微生物生物量碳氮的養(yǎng)分釋放提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 實驗樣地

研究地點位于四川省阿壩州松潘縣章臘鄉(xiāng)卡卡山的中科院成都生物所生態(tài)站實驗基地(32°59′N, 103°40′E, 海拔3 500 m).年均溫2.8 ℃，一月均溫-7.6 ℃，每年11月底或12月初出現(xiàn)持續(xù)的積雪覆蓋.土壤為棕色草氈土(pH 5.42～5.83,土壤有機質(zhì)SOM 44.23～62.00 g/kg, 總氮TN 3.51～5.12 g/kg)，平均土層厚度約為63 cm，植物根系主要分布于2～20 cm深的土層.

1.2 實驗設計

在實驗基地內(nèi)設置5個3 m×5 m的樣地，用原位PVC管采用對角線法取足夠的土壤.帶回實驗室后移去可見的雜質(zhì)和植物根后，將土壤混合均勻，調(diào)節(jié)含水率為70%，在25 ℃恒溫下穩(wěn)定1周后將土壤裝入45個塑料培養(yǎng)盒中(每盒裝入250 g).再將45個培養(yǎng)盒分成5組，每組分別加入不同濃度的葡萄糖溶液，得到4個碳濃度梯度和1個對照組，分別為0 mg/g (CK)、 1 mg/g(C1)、2 mg/g(C2)、4 mg/g(C3)和8 mg/g(C4).然后將每個碳濃度梯度組的土樣再隨機劃分為3個溫度處理亞組(5次重復).按照Sulkava(2003)的方法分別進行3個溫度梯度模擬實驗(大幅度凍融-20 ℃～2 ℃， 小幅度凍融-2～2 ℃，持續(xù)低溫凍結-2 ℃).培養(yǎng)結束后測試土壤內(nèi)微生物生物量，微生物數(shù)量和土壤酶活性.

1.3 測試方法

稀釋平板計數(shù)法測定土壤細菌和真菌數(shù)量；氯仿熏蒸-浸提法測定微生物生物量碳(MBC)和微生物生物量氮(MBN)的質(zhì)量分數(shù)；3, 5-二硝基水楊酸比色法測定土壤蔗糖酶活性；高錳酸鉀滴定法測定土壤過氧化氫酶活性；茚三酮比色法測定土壤蛋白酶活性[8].

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2017進行處理，用SPSS 13.0進行雙因素方差分析(ANOVA)，最小顯著差異法(LSD)比較組間差異，顯著性水平設為α=0.05.Excel 2017軟件繪制折線圖.

2 結果和分析

2.1 土壤微生物數(shù)量

土壤中的細菌數(shù)量和真菌數(shù)量隨著短期外源碳添加的增加而逐漸增加，尤其大量的碳輸入時(C3，C4)尤為明顯(圖1).C4組土壤細菌數(shù)量增加到了對照的1.19～4.27倍，土壤真菌數(shù)量增長更為明顯，達到了對照組的7.23～22.27倍之多.直觀上看，大量碳輸入時土壤凍融增加了細菌數(shù)量，而小幅度凍融增加了真菌數(shù)量.短期碳輸入極顯著增加了細菌和真菌數(shù)量(P<0.01)，小幅度凍融顯著增加了真菌數(shù)量(P<0.05)，而凍融交替對細菌數(shù)量無統(tǒng)計學上的影響(P>0.05).碳輸入和凍融交替的交互效應對細菌數(shù)量的影響也極其顯著(P<0.01)，表現(xiàn)為當大幅度凍融時，C4組極顯著的大于其他碳添加處理.

2.2 土壤微生物生物量碳氮質(zhì)量分數(shù)

與微生物數(shù)量變化趨勢一致，MBC和MBN質(zhì)量分數(shù)也隨著短期外源碳輸入的增加而逐漸增加(圖2).與對照組相比，C4組MBC和MBN分別增加了30.90%～58.13%和45.04%～137.71%.短期碳輸入極顯著的增加了MBC和MBN質(zhì)量分數(shù)(P<0.01)，而凍融交替和兩者的交互作用均無統(tǒng)計學差異(P>0.05).

1)同一凍融處理下，碳輸入處理組與對照組相比，P<0.05. 2)同一碳處理下，與持續(xù)凍結相比，P<0.05.

微生物生物量碳氮比(wMBC/wMBN)則隨著外源碳輸入的增加而呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(圖2).C4組的wMBC/wMBN比對照組降低了19.98%～47.18%(P<0.01).大幅度的凍融顯著降低了wMBC/wMBN(P<0.05)，比持續(xù)低溫凍結和小幅度凍融分別降低了5.53%～25.27%和4.47%～36.94%.

2.3 土壤酶活性

土壤過氧化氫酶和纖維素酶活性在不同的凍融條件下表現(xiàn)出較一致的變化趨勢(圖3)，具體表現(xiàn)為小幅度凍融交替時酶活性最高，顯著高于持續(xù)低溫凍結和大幅度凍融交替時的酶活性(P<0.05).而土壤蔗糖酶活性則表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律，其酶活性在持續(xù)的低溫凍結時明顯增加，而大幅度的凍融交替時則顯著降低(P<0.01).

短期外源碳輸入對不同的3種土壤酶活性呈現(xiàn)不同的規(guī)律.過氧化氫酶活性無規(guī)律性的影響，卻顯著提高了纖維素酶和蔗糖酶活性(P<0.05)，大量外源碳輸入時尤為明顯.C4組纖維素酶活性比對照組增加了59.13%～62.33%，蔗糖酶活性比對照組增加了38.63%～169.23%.同時，凍融交替和外源碳輸入的交互作用對蔗糖酶的影響顯著(P<0.05)，具體表現(xiàn)為在持續(xù)低溫凍結C4組蔗糖酶活性顯著高于其他碳輸入水平的酶活.

1)同一凍融處理下，碳輸入處理組與對照組相比，P<0.05. 2)同一碳處理下，與持續(xù)凍結相比，P<0.05.

1)同一凍融處理下，碳輸入處理組與對照組相比，P<0.05. 2)同一碳處理下，與持續(xù)凍結相比，P<0.05.

3 討論

植物凋落物的輸入和土壤碳源的輸入可以引起土壤碳庫和養(yǎng)分庫的動態(tài)變化，進而影響土壤微生物群落和活性[9-13].之前的研究說明，土壤食物鏈和微生物活性是被能量限制的，土壤中大量營養(yǎng)元素和微量營養(yǎng)元素的流動是和可利用碳相聯(lián)系的[14].然而，以往關于增加植物碳輸入能否改變微生物群落結構和活性的研究仍然存在一些爭議.例如，Nadelhoffer等的研究發(fā)現(xiàn)，地上施加有機碳源5年后并未引起土壤細菌或真菌生物量的任何變化[15].也有研究表明，連續(xù)2～6年施加碳源后，土壤酶活性也沒有顯著變化[16].本研究結果與之前大多數(shù)的結論一致[17-20]，短期外源碳的添加顯著增加了細菌和真菌數(shù)量，微生物生物量碳氮質(zhì)量分數(shù)，以及纖維素酶和蔗糖酶活性，說明微生物生長和活性的潛在限制作用被減輕或消除了，對土壤真菌而言尤為如此.冬季真菌對碳的需求量是細菌的3倍，因而更容易受到有效碳的限制[14]，外源大量碳的輸入導致真菌數(shù)量急劇增加，明顯減輕或消除了真菌營養(yǎng)限制的影響.究其原因，也有可能是不同微生物群落在對新輸入有機質(zhì)的利用存在競爭機制，而真菌群落的生長策略使其具有更強的激發(fā)效應[21].

土壤季節(jié)性凍融是在表土以下的一定深度形成的反復凍結和解凍的過程，是普遍存在于高海拔地區(qū)的一種重要現(xiàn)象[22-23].凍融可以改變土壤的物理、化學和生物性質(zhì)，其頻率、速度和溫度變化范圍對土壤微生物狀況有很大的影響.不少學者對土壤凍融期間微生物活性、數(shù)量、群落結構等方面開展了研究.結果表明，凍融會改變土壤結構，殺死大量土壤微生物，導致微生物活性下降或死亡，降低土壤微生物MBN質(zhì)量分數(shù)[23-26].由于不同生態(tài)系統(tǒng)中微生物對于溫度和環(huán)境的耐受度不同，因而也有研究得出了不同的結果.王楠等[27]在黑龍江帽兒山的研究表明，晝夜凍融導致土壤微生物群落結構發(fā)生改變，具體表現(xiàn)為真菌相對豐度明顯減小，細菌相對豐度則呈增大趨勢.而在川西高原岷江地區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)[28]，溫和的凍融事件會破壞土壤團聚體結構，促進土壤毛細管中的溶解態(tài)碳氮養(yǎng)分被固定，并促進土壤有機質(zhì)和有效養(yǎng)分的釋放，因而更有利用于微生物數(shù)量和活性的增長.王懷玉等[29]對川西亞高山森林土壤微生物群落的研究也證實，在季節(jié)性土壤凍結過程中真菌數(shù)量顯著增加.本研究也支持這個結論，雖然變溫幅度較大的凍融顯著降低微生物的數(shù)量和活性，但小幅度的凍融交替顯著增加了真菌數(shù)量，過氧化氫酶和纖維素酶的活性.可能有以下幾方面的原因：①變溫范圍大的凍融，其凍結后的最終溫度很可能低于微生物細胞的可耐受臨界溫度，凍結產(chǎn)生的冰晶體膨脹對真菌細胞膜造成嚴重的機械損傷，導致可培養(yǎng)真菌數(shù)量減少[30].②變溫幅度大的凍融交替在土壤劇烈凍結時段其自由水含量已經(jīng)遠遠不能滿足微生物活動所需，致使大量冷敏感菌死亡或休眠，而在土壤融化時段土壤水分快速增加又使微生物在短時間內(nèi)處于厭氧環(huán)境中，導致微生物活力的下降和總體數(shù)量的減少[27, 31-32].③變溫幅度小的凍融使土壤自由水含量增加，土壤中的有效養(yǎng)分得到釋放和轉(zhuǎn)運，刺激了真菌的快速生長和繁殖，同時真菌菌絲體能夠利用土壤顆粒周圍吸附的自由水以保持自身生理代謝活性，致使小幅度凍融下土壤真菌數(shù)量顯著增大[30].④變溫幅度小的凍融使土壤團聚體被適度破壞，被固定在土壤中的有效底物及破碎的土壤團粒、植物根系、凋落物和死亡的微生物釋放出大量的營養(yǎng)物質(zhì)，從而激活了土壤酶活性[23].

4 結論

短期外源碳輸入顯著增加了微生物數(shù)量，微生物生物量，土壤纖維素酶和蔗糖酶的活性，表明青藏高原東部冬季高寒土壤微生物的碳限制作用隨著外源碳的輸入而減輕或消除.大幅度的凍融交替顯著降低了蔗糖酶活性，而小幅度溫和的凍融交替卻顯著增加了真菌數(shù)量，過氧化氫酶和纖維素酶的活性，說明冬季高寒地區(qū)適度溫和的凍融對微生物有利，并進一步對土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化有積極參加作用.