陳 瑤，張 穎，周慶兵，徐鳳芹

國際糖尿病聯(lián)盟數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，2017年全球已確診糖尿病病人達(dá)4.51億人，2045年將攀升至6.93億人[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國糖尿病患病人數(shù)居世界首位，且存在患病率高、綜合控制達(dá)標(biāo)率低的特點(diǎn)，已成為嚴(yán)重危害我國人民生命健康的公共衛(wèi)生問題[2]。糖尿病可引起多種并發(fā)癥，其中最常見的是糖尿病血管病變，大血管病變的病理特征是主動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈、肢體外周動(dòng)脈等發(fā)生粥樣硬化，這也是病人致死的主要因素[3]。

糖尿病屬于中醫(yī)學(xué)“消渴病”范疇，氣虛血瘀是糖尿病血管病變的主要病機(jī)[4]。益氣活血方由川芎、赤芍、西洋參3味中藥組成。其中川芎行氣活血、祛風(fēng)止痛，赤芍清熱涼血、散瘀止痛，西洋參補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱生津，3藥配伍共奏益氣養(yǎng)陰、活血化瘀之功。研究表明，川芎-赤芍藥對(duì)可以通過抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)、調(diào)節(jié)糖脂代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[5-8]。西洋參皂苷及多糖等成分有明顯的降糖作用[9-11]，其機(jī)制可能與促進(jìn)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[12-13]、改善胰島素抵抗[14-15]、增強(qiáng)胰腺β細(xì)胞的抗氧化作用[16-18]、恢復(fù)內(nèi)皮功能[19]有關(guān)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以系統(tǒng)生物學(xué)、基因組學(xué)、蛋白組學(xué)等學(xué)科為理論基礎(chǔ)，運(yùn)用高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析、計(jì)算機(jī)模擬及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫搜索等技術(shù)，呈現(xiàn)藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)圖，在闡明中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制、中藥藥性理論、中藥毒性作用機(jī)制等方面有很大突破。其整體性、系統(tǒng)性和綜合性與中藥多成分、多靶點(diǎn)、整體性的特點(diǎn)十分契合，目前已成為中藥研究的常用手段[20-24]。本研究旨在運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探討益氣活血方干預(yù)糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化的靶點(diǎn)及作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 益氣活血方活性成分的篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)[25]，以川芎、赤芍、西洋參為檢索詞進(jìn)行檢索，結(jié)合文獻(xiàn)挖掘，獲得益氣活血方的活性成分信息。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為條件篩選活性成分[26]。運(yùn)用TCMSP以及Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(www.swisstargetprediction.ch)對(duì)益氣活血方活性成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。將得到的靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化，刪除重復(fù)值并整合。檢索日期為建庫至2021年2月7日。

1.2 糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 以“diabetes mellitus”和“atherosclerosis”為檢索詞，“Homo sapiens”為限定條件，在Genecards數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/)、OMIM(http://www.omim.org/)等疾病數(shù)據(jù)庫檢索，初步篩選疾病相關(guān)靶蛋白，將得到的靶蛋白導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化，刪除重復(fù)值并整合，建立疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。檢索日期為建庫至2021年2月7日。

1.3 構(gòu)建益氣活血方“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 使用可視化軟件Cytoscape 3.7.1構(gòu)建益氣活血方“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，其中“節(jié)點(diǎn)”(node)表示活性成分或作用靶點(diǎn)，“邊”(edge)表示兩者之間的關(guān)系。再利用軟件中的“Network Analyzer”功能對(duì)自由度(degree)等網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以描述活性成分與作用靶點(diǎn)之間的關(guān)系。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 運(yùn)用Cytoscape 3.7.1軟件中的插件BisoGenet將上述得到的活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用(PPI)。利用Merge功能提取2個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)的交集網(wǎng)絡(luò)，利用CytoNCA[27]分析網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)屬性值。通過對(duì)degree、betweenness、closeness值篩選后得到關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.5 生物學(xué)功能和通路分析 將篩選后的基因?qū)隡etascape平臺(tái)進(jìn)行基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析，保存結(jié)果并通過R語言進(jìn)行可視化。

2 結(jié) 果

2.1 益氣活血方活性成分信息及靶點(diǎn)信息 從TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取益氣活血方成分461個(gè)，其中包含川芎成分189個(gè)，赤芍成分119個(gè)，西洋參成分153個(gè)。通過對(duì)口服生物利用度及類藥性參數(shù)調(diào)整，獲取益氣活血方有效成分28個(gè)，其中包含川芎有效成分7個(gè)，赤芍有效成分14個(gè)，西洋參有效成分9個(gè)。其中川芎、赤芍共有的有效成分1個(gè)(sitosterol，A1)，赤芍、西洋參共有的有效成分1個(gè)(Beta-sitosterol)。具體成分見表1。共獲得藥物靶點(diǎn)185個(gè)，其中川芎29個(gè)，赤芍99個(gè)，西洋參57個(gè)，去除重復(fù)值后最終獲得靶點(diǎn)122個(gè)。

表1 益氣活血方活性成分

2.2 益氣活血方活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析 利用Cytoscape 3.7.1對(duì)益氣活血方活性成分及其作用靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖的繪制和分析，共獲得150個(gè)節(jié)點(diǎn)(包含122個(gè)靶點(diǎn)和28個(gè)活性成分)與297條關(guān)系。詳見圖1。

2.3 糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化靶點(diǎn)檢索 在Genecards數(shù)據(jù)庫中檢索到16 594個(gè)靶點(diǎn)，經(jīng)篩選后為1 102個(gè)靶點(diǎn)，在OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索到217個(gè)靶點(diǎn)，在Drugbank數(shù)據(jù)庫中搜索到52個(gè)靶點(diǎn)，去除重復(fù)值匯總后，最終得到糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化靶點(diǎn)1 275個(gè)。藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)交集為52個(gè)。詳見圖2。

圖2 藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)Venn圖

2.4 益氣活血方治療糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

2.4.1 益氣活血方治療糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運(yùn)用Cytoscape內(nèi)的BisoGenet插件分別構(gòu)建益氣活血方和糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化的PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示：益氣活血方潛在靶點(diǎn)與4 924個(gè)靶點(diǎn)產(chǎn)生直接或間接作用，其相互關(guān)系達(dá)121 050種。與糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化直接或間接相關(guān)的靶點(diǎn)有11 516個(gè)，靶點(diǎn)間相互作用關(guān)系有229 013種，兩者交集網(wǎng)絡(luò)圖見圖3。

圖3 益氣活血方與糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化交集PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4.2 益氣活血方治療糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 計(jì)算兩者交集PPI的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)特征屬性值后，進(jìn)行2次篩選，最終獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)191個(gè)，具體篩選策略見圖4，最終結(jié)果見圖5。

圖4 關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的篩選策略圖

圖5 益氣活血方核心靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 益氣活血方治療糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化通路富集分析 運(yùn)用Metascape平臺(tái)對(duì)上述191個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)進(jìn)行基因富集分析，包括GO的生物學(xué)過程(biological process，BP)、細(xì)胞成分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)和KEGG通路分析，選取Log10(P)值排名前20的結(jié)果將其進(jìn)行可視化。將BP、CC、MF和KEGG通路結(jié)果使用R語言分別繪制氣泡圖，氣泡顏色由綠色到紅色代表Log10(P)值從小到大，氣泡面積代表該通路的基因個(gè)數(shù)，橫軸代表該通路基因占所有基因的比率。共獲得KEGG通路264條，富集結(jié)果顯示，益氣活血方治療糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化主要涉及的信號(hào)通路為MAPK信號(hào)通路、Foxo信號(hào)通路、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)信號(hào)通路。詳見圖6、圖7。

圖6 益氣活血方治療糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化通路富集分析氣泡圖

圖7 益氣活血方治療糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化作用靶點(diǎn)富集氣泡圖

3 討 論

3.1 藥物活性成分分析 由表1和圖1可知，益氣活血方治療糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化的主要成分可能為β-谷甾醇(β-sitosterol)、黃芩苷(Baicalin)、人參皂苷Rh2(Ginsenoside Rh2)。川芎、赤芍共有成分為3-Epi-beta-sitosterol，赤芍、西洋參共有成分為Beta-sitosterol，兩者分子式和分子質(zhì)量相同，僅3D結(jié)構(gòu)式不同，此處將兩者歸為一類探討其作用效應(yīng)。β-谷甾醇是植物甾醇常見的一種，在川芎、赤芍、西洋參中均存在。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明β-谷甾醇可以通過增加脂肪組織中的胰島素受體和激活葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)控制血糖，還可以通過IRS-1/Akt介導(dǎo)的胰島素信號(hào)通路改善胰島素抵抗[28-29]，其降脂、抗炎、抗氧化作用也得到了證實(shí)[30-33]。赤芍的活性成分包含黃芩苷、鞣花酸等，其中黃芩苷可以通過調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，有效降低高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞黏附分子和超氧化物歧化酶(SOD)的增加，改善血管通透性[34]，還通過Akt/AS160/GLUT4和p38MAPK/PGC1α通路改善胰島素抵抗[35]。西洋參的活性成分包含人參皂苷Rh2、罌粟堿等。其中二醇型人參皂苷Rh2可以通過Akt/Foxo1/PDX1信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)和周期蛋白的調(diào)控逆轉(zhuǎn)受損β細(xì)胞的生長趨勢(shì)，促進(jìn)β細(xì)胞增殖[36-37]。還可以增強(qiáng)抗脂質(zhì)過氧化功能，清除氧自由基，穩(wěn)定細(xì)胞膜，從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[38]。

3.2 關(guān)鍵靶點(diǎn)分析 本研究經(jīng)篩選后得到191個(gè)核心靶點(diǎn)。根據(jù)degree值排序，其中較為重要的有腫瘤蛋白53(TP53)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)、熱休克蛋白90(HSP90)、血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1(VCAM-1)。TP53是炎癥、凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[39]，研究表明，TP53可抑制血管內(nèi)皮生長因子轉(zhuǎn)錄[40]，降低動(dòng)脈粥樣硬化程度[41]。HSP90可以通過內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)介導(dǎo)一氧化氮和超氧化物陰離子的平衡，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，保護(hù)血管內(nèi)皮，從而延緩糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[42-43]。CDK2是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程的重要細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶，抑制它的活性可有效對(duì)抗高糖的促增殖效應(yīng)[44-45]。VCAM-1可促進(jìn)炎性細(xì)胞的遷移與增殖，大量的單核細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)皮下成為泡沫細(xì)胞，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的產(chǎn)生[46]，該過程與NF-κB、PI3K-Akt/PKB通路相關(guān)[47-48]。

3.3 通路與生物進(jìn)程分析 本研究共獲得KEGG通路264條，富集結(jié)果顯示，益氣活血方治療糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化主要涉及MAPK信號(hào)通路、Foxo信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路。

血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的異常增殖和遷移在糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化過程中發(fā)揮重要作用[49-50]，MAPK信號(hào)通路參與其中[51]，p38MAPK是關(guān)鍵因子。體外實(shí)驗(yàn)表明，抑制p38MAPK信號(hào)通路激活eNOS磷酸化，可拮抗糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和一氧化氮(NO)生成障礙，從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞延緩動(dòng)脈粥樣硬化[52]。調(diào)控AGEs/p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以降低丙二醛(MDA)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、VCAM-1、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)，減少內(nèi)皮損傷[53-55]。抑制p38MAPK/TLR4信號(hào)通路及炎癥反應(yīng)[56]。

TGF-β信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、凋亡、侵襲、細(xì)胞外基質(zhì)合成、血管新生及免疫等方面發(fā)揮作用[57-58]，其下游信號(hào)通路包括Smad、ERK、p38MAPK、JNK、Akt等。激活轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)/p38MAPK信號(hào)通路可以促進(jìn)CREB磷酸化，誘導(dǎo)平滑肌增殖[59-61]。抑制TGF-β1/Smad2信號(hào)通路可以降低Nox4表達(dá)，減輕內(nèi)膜損傷[62]。

Foxo通路參與細(xì)胞代謝、生長、分化、氧化應(yīng)激、衰老、自噬等多種生理和病理過程[63]。與糖尿病及動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的主要是Foxo1。抑制Foxo1活性可下調(diào)促凋亡因子表達(dá)，上調(diào)成熟β細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)，從而減少β細(xì)胞凋亡并改善β細(xì)胞增殖[64]，F(xiàn)oxo1的上調(diào)會(huì)導(dǎo)致鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠不良血管的重塑[65]。抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路可以抑制Foxo1核易位，下調(diào)糖異生相關(guān)基因，從而抑制糖異生并增強(qiáng)胰島素敏感性[66]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)益氣活血方干預(yù)糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化的主要成分可能是β-谷甾醇、黃芩苷、人參皂苷Rh2，涉及MAPK、Foxo、TGF-β等多個(gè)信號(hào)通路，與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞異常增殖和凋亡、細(xì)胞周期、能量代謝等生物學(xué)過程相關(guān)。本研究的局限性有：①中藥復(fù)方經(jīng)煎煮及體內(nèi)作用后的入血成分有可能與生藥不同，且劑量及濃度的不同會(huì)產(chǎn)生不同作用；②目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)主要針對(duì)西醫(yī)疾病病名，忽視了中醫(yī)辨證論治的特色；③網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的基礎(chǔ)是已驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)研究和數(shù)據(jù)庫，但實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)存在不確定性。目前本課題組已經(jīng)對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，初步證實(shí)益氣活血方有明確的降血糖、改善胰島素抵抗、縮小動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積、下調(diào)炎性因子的作用，后續(xù)將以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合課題全基因組甲基化結(jié)果，從表觀遺傳學(xué)角度進(jìn)行深入研究與挖掘。