張曉燕 薛晨晨 黃璐 袁星星 陳新

摘要：為明確不同種皮顏色小豆及其芽苗菜功能性成分的差異，分別對6種不同種皮顏色小豆及其芽苗菜的酚類化合物、黃酮類化合物、異黃酮、皂苷和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，γ-GABA）等功能性成分含量進(jìn)行比較，并分析體外抗氧化能力。結(jié)果表明，小豆種子富含酚類化合物、黃酮類化合物、異黃酮、皂苷和γ-GABA等功能性成分，且具有較高的抗氧化能力。黑色種皮的蘇黑珠1號(hào)小豆種子總酚類化合物、總黃酮類化合物、皂苷和γ-GABA含量最高，抗氧化能力最強(qiáng)，且蘇黑珠1號(hào)小豆芽苗菜產(chǎn)量最高。與種子相比，蘇品紅1號(hào)和蘇黃1號(hào)小豆芽苗菜總酚類和總黃酮類化合物含量顯著提高，蘇灰1號(hào)和蘇黑珠1號(hào)小豆芽苗菜異黃酮含量顯著提高?？傮w而言，供試小豆品種中蘇黑珠1號(hào)小豆不僅富含功能性成分，而且抗氧化能力也較強(qiáng)，具有良好的開發(fā)前景。

關(guān)鍵詞：小豆;芽苗菜;酚類化合物;抗氧化;黃酮類化合物;異黃酮;γ-GABA

中圖分類號(hào)： S521.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）07-0180-06

收稿日期：2020-08-06

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31902001）;國家食用豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生物防治與綜合防控崗位科學(xué)家（編號(hào)：CARS-08-G15）;江蘇省特糧特經(jīng)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系集成創(chuàng)新中心（編號(hào)：JATS[2019]399）。

作者簡介：張曉燕（1988—），女，山東煙臺(tái)人，博士，助理研究員，主要從事豆類功能育種與應(yīng)用研究。E-mail：xyzhang@jaas.ac.cn。

通信作者：陳 新，博士，研究員，主要從事豆類作物遺傳育種研究。E-mail：cx@ jaas.ac.cn。

小豆[Vigna angularis （Willd） Ohwi & Ohashi]是我國主要食用豆之一，在菜用、藥用和產(chǎn)品加工等方面具有較好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。小豆不僅含有蛋白質(zhì)、碳水化合物、膳食纖維、維生素和礦物質(zhì)等基本營養(yǎng)物質(zhì)，還富含多酚、黃酮類化合物和皂苷等功能性成分[2-3]。小豆中的功能性成分具有降血壓、降血脂、調(diào)節(jié)血糖、抗菌、抗氧化等保健功效，并有助于控制或預(yù)防慢性和退行性疾病[4]。

發(fā)芽是一種簡單、有效且低成本的改善豆類營養(yǎng)品質(zhì)的技術(shù)。大量研究表明，發(fā)芽是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，它不僅降低了抗?fàn)I養(yǎng)因子等不利成分，提高了蛋白質(zhì)的吸收利用率，還會(huì)引起功能性成分含量發(fā)生顯著變化[3]。小豆芽苗菜口感鮮嫩且營養(yǎng)豐富，具有生長周期短、栽培方式靈活等特點(diǎn)，市場前景廣闊。前期研究表明，豆類芽苗菜的營養(yǎng)品質(zhì)主要取決于種子的品質(zhì)和特性[5-6]。目前，關(guān)于小豆芽苗菜營養(yǎng)成分的研究多集中于比較同一品種在不同處理下的營養(yǎng)成分變化[7]，因此有必要利用種質(zhì)資源優(yōu)勢系統(tǒng)研究不同品種小豆及其芽苗菜功能性成分及抗氧化特性。

本研究以江蘇省特有的6個(gè)不同種皮顏色小豆品種為試驗(yàn)材料，系統(tǒng)研究其種子及芽苗菜的功能性成分含量及抗氧化特性，分析比較不同品種小豆芽苗菜的生長特性，以期為小豆生產(chǎn)和豆類芽苗菜的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

試驗(yàn)于2019年11月至2020年3月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所進(jìn)行。試驗(yàn)材料為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)作所豆類作物研究室自主育成的6個(gè)不同種皮顏色小豆品種，各試驗(yàn)材料及其性狀詳見表1。挑選大小均勻、整齊一致且無破損的小豆種子，用0.1%次氯酸鈉溶液消毒后，播種于豆芽機(jī)。將豆芽機(jī)置于人工氣候培養(yǎng)箱中，黑暗中進(jìn)行催芽，培養(yǎng)溫度和相對濕度分別為25 ℃和80%。在黑暗中培養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)移至LED白光下培養(yǎng)，相對濕度為80%，溫度為25 ℃/18 ℃（白天/黑夜），光照時(shí)間12 h/12 h（白天/黑夜），光照度 30 μmol/（m2·s）。豆芽機(jī)每2 h淋水1次，每天更換1次自來水。小豆芽苗菜生長至10 d時(shí)進(jìn)行取樣。用吸水紙吸干芽苗菜表面水分后快速冷凍到液氮中，并保存至-80 ℃冰箱待用。樣品經(jīng)過冷凍干燥處理后用于測定功能性成分含量和抗氧化能力。

1.2 生長指標(biāo)測定

小豆芽苗菜生長至10 d時(shí)取樣測定生長指標(biāo)，包括株高、可食用鮮質(zhì)量、全株鮮質(zhì)量和產(chǎn)量。

產(chǎn)量：以每100 g種子生產(chǎn)出的可供食用的芽苗菜計(jì)算，單位g/100 g。

可食率=（可食用鮮質(zhì)量/全株鮮質(zhì)量）×100%。

1.3 總酚類和總黃酮類化合物含量測定

總酚類和總黃酮類化合物含量的提取和測定參照 Bobo-García 等的方法[8]，略有改動(dòng)。稱取0.5 g凍干后研磨至粉末狀的樣品，加入5 mL提取液，充分混勻，于30 ℃超聲提取10 min，4 ℃下 12 000 r/min 離心20 min，收集上清作為待測提取液?？偡宇愇镔|(zhì)含量用福林-肖卡法測定，取上述20 μL提取液于96孔酶標(biāo)板，加入100 μL福林酚試劑，充分混勻后加入75 μL 10%碳酸鈉溶液，充分混勻，室溫下黑暗中反應(yīng)2 h，測定750 nm處的吸光度。以沒食子酸（gallic acid）標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，總酚類化合物含量以干質(zhì)量表示，單位為mg/100 g。

總黃酮類化合物含量的測定參考Horszwald等的方法[9]。取25 μL提取液于96孔酶標(biāo)板，加入75 μL 95%乙醇溶液，充分混勻后依次加入5 μL 10%氯化鋁溶液、5 μL 1mol/L乙酸鉀溶液和 140 μL 去離子水，充分混勻后室溫反應(yīng)30 min，測定510 nm處的吸光度。以蕓香苷（rutin）為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，總黃酮類化合物含量以干質(zhì)量表示，單位為mg/100 g。

1.4 總異黃酮含量的測定

總異黃酮含量的測定參照Ma等的方法[10]，略作改動(dòng)。取0.2 g樣品，加入5 mL 80%甲醇（色譜純），60 ℃超聲提取20 min，重復(fù)提取1次，離心（12 000 r/min，20 min）后合并上清，將上清過 0.45 μm 濾膜后轉(zhuǎn)入高效液相色譜（HPLC）專用色譜瓶中，4 ℃保存待測。液相色譜柱為Phenomenex C18（150 mm×4.6 mm，0.5 μm），流動(dòng)相A為0.1%甲酸-水溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸-乙腈溶液。梯度洗脫，洗脫程序：0～10 min，B：13%～18%;10～23 min，B：18%～24%;23～30 min，B：24%～35%;30～50 min，B：35%;50～51 min，B：35%～13%。流速1 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長 260 nm，進(jìn)樣量10 μL。大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品染料木素（Genistein）、染料木苷（Genistin）、大豆苷元（Daidzein）、大豆苷（daidzin）和黃豆黃苷（Glycitin）均購自Sigma公司。

1.5 皂苷含量的測定

皂苷含量的測定參考Chen等的方法[11]，略作改動(dòng)。取0.5 g樣品，加入10 mL 80%甲醇，60 ℃恒溫水浴振蕩提取3 h，4 ℃下12 000 r/min離心 20 min，收集上清作為待測液。取0.1 mL待測液，依次加入0.4 mL 80%甲醇、0.5 mL 8%香草醛-乙醇溶液和5 mL 72%硫酸溶液，冰浴混合，60 ℃水浴10 min，冷卻后測定544 nm處的吸光度。以大豆皂苷標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品中大豆皂苷含量以干質(zhì)量表示，單位為mg/g。

1.6 γ-氨基丁酸（γ-GABA）含量的測定

γ-GABA含量的測定參考Sharma等的方法[12]，并略作改動(dòng)。取0.1 g樣品，加入1 mL 70%乙醇，60 ℃超聲提取20 min，4 ℃下12 000 r/min離心20 min，重復(fù)提取1次，收集上清并濃縮，濃縮后的提取液作為待測液。測定時(shí)取0.1 mL待測液，加入0.2 mL 0.2 mol/L硼酸緩沖液（pH值9.0）、1 mL 6%酚試劑和0.4 mL 7.5%次氯酸鈉溶液。將上述混合反應(yīng)液沸水浴10 min，冰浴冷卻后測定630 nm處的吸光度。以γ-GABA為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中γ-GABA含量以干質(zhì)量表示，單位為mg/g。

1.7 抗氧化能力的測定

待測液的提取方法參考“1.3”節(jié)總酚類物質(zhì)含量測定。二苯代苦味?；杂苫―PPH）清除能力、鐵離子還原抗氧化能力（FRAP）和氧自由基吸收能力（ORAC）的測定參考Horszwald等的方法[9]。

1.8 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)所有樣品均隨機(jī)取樣，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用3次生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，顯著性采用Duncans新復(fù)極差法檢驗(yàn)（P<0.05）。相關(guān)性分析用Origin 2018軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種小豆及其芽苗菜的功能性成分分析

由圖1可知，蘇黑珠1號(hào)小豆種子的總酚類化合物含量最高（17.43 mg/100 g），顯著高于除蘇白1號(hào)外的其他小豆種子，而蘇品紅1號(hào)小豆種子的總酚類化合物含量最低，僅為蘇黑珠1號(hào)的40.59%。蘇黑珠1號(hào)小豆種子的總黃酮類化合物含量顯著高于其他品種，而異黃酮含量顯著低于除蘇灰1號(hào)外的其他品種。蘇品紅1號(hào)小豆芽苗菜的總酚類化合物含量最低，蘇灰1號(hào)小豆芽苗菜總酚類化合物含量最高，為蘇品紅1號(hào)的1.41倍。蘇品紅1號(hào)、蘇黃1號(hào)和蘇白1號(hào)小豆芽苗菜的總黃酮類化合物含量顯著高于相應(yīng)的小豆種子，分別是其種子的1.39、1.34、1.10倍。類似的，蘇灰1號(hào)和蘇黑珠1號(hào)小豆芽苗菜的異黃酮含量顯著高于種子，分別是其種子的1.24、1.38倍。

由圖2可知，小豆種子的皂苷含量較高，其中蘇黑珠1號(hào)小豆種子的皂苷含量顯著高于其他品種小豆種子，蘇品紅1號(hào)、蘇黃1號(hào)和蘇白1號(hào)小豆芽苗菜的皂苷含量均顯著高于蘇黑珠1號(hào)小豆芽苗菜。蘇灰1號(hào)和蘇黑珠1號(hào)小豆種子的γ-GABA含量顯著高于其他品種小豆種子，蘇翡翠1號(hào)小豆芽苗菜的γ-GABA含量顯著高于其他品種小豆芽苗菜。

2.2 小豆芽苗菜的生長特性

由圖3和表2可知，蘇品紅1號(hào)、蘇黃1號(hào)和蘇白1號(hào)小豆芽苗菜的株高較低，顯著低于蘇灰1號(hào)和蘇黑珠1號(hào)小豆芽苗菜;蘇黑珠1號(hào)小豆芽苗菜的產(chǎn)量最高（500.66 g/100 g），顯著高于除蘇黃1號(hào)和蘇灰1號(hào)之外的其他小豆芽苗菜，而蘇品紅1號(hào)小豆芽苗菜的產(chǎn)量最低（235.68 g/100 g）。各品種小豆芽苗菜的可食用鮮質(zhì)量、全株鮮質(zhì)量和可食率無顯著性差異。

2.3 不同品種小豆及其芽苗菜抗氧化能力分析

利用DPPH·清除能力、FRAP、ORAC 3種評(píng)價(jià)方法對小豆種子和芽苗菜的抗氧化能力進(jìn)行測定（圖4）?？梢钥闯?，蘇灰1號(hào)和蘇黑珠1號(hào)小豆種子的DPPH·清除能力顯著高于其他小豆種子，蘇黑珠1號(hào)小豆種子的FRAP和ORAC值均顯著高于其他小豆種子，此外蘇白1號(hào)小豆種子的FRAP值顯著高于除蘇黑珠1號(hào)之外的其他小豆種子。不同品種小豆芽苗菜之間相比，蘇白1號(hào)小豆芽苗菜的DPPH·清除能力和FRAP值均顯著高于其他品種小豆芽苗菜，而蘇品紅1號(hào)小豆芽苗菜的DPPH·值均顯著低于其他品種小豆芽苗菜。與小豆種子相比，蘇品紅1號(hào)小豆芽苗菜的DPPH·、FRAP和ORAC值分別是其種子的1.08、1.34、1.27倍。

2.4 功能性成分與抗氧化能力相關(guān)性分析

對小豆種子及其芽苗菜的功能性成分含量和抗氧化能力進(jìn)行相關(guān)性分析（表3）表明，小豆種子總酚類化合物含量與DPPH·清除能力顯著正相關(guān)，與FRAP和ORAC極顯著正相關(guān)。總黃酮類化合物含量與DPPH·清除能力、FRAP和ORAC顯著或極顯著正相關(guān)，γ-GABA含量與DPPH·清除能力顯著正相關(guān)，而異黃酮含量與DPPH·清除能力顯著負(fù)相關(guān)。小豆芽苗菜的總酚類化合物含量與DPPH·清除能力顯著正相關(guān)，而總黃酮類化合物含量與DPPH·清除能力、FRAP和ORAC均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

3 結(jié)論與討論

豆類芽苗菜是一類利用豆類種子貯存的營養(yǎng)物質(zhì)，使種子在適宜條件下萌發(fā)而產(chǎn)生的可食用幼苗。與大宗蔬菜相比，豆類芽苗菜具有風(fēng)味獨(dú)特、口感脆嫩、生育周期短和生產(chǎn)不受季節(jié)限制等特點(diǎn)，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的蔬菜[13]。豆類芽苗菜主要包括黃豆（大豆）芽、綠豆芽、黑豆苗、豌豆苗、小豆苗和蠶豆苗等。目前，黃豆芽和綠豆芽消費(fèi)需求量大，同時(shí)由于其整個(gè)生育期間均在無光或者弱光條件下完成，前、中、后期培育條件較一致，所以工廠化、機(jī)械化、產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程較快;而小豆芽苗菜等是伴隨現(xiàn)代設(shè)施農(nóng)業(yè)、立體栽培農(nóng)業(yè)和現(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)展起來的新型特色蔬菜，系統(tǒng)研究不同品種小豆及其芽苗菜的芽用特性及相關(guān)栽培技術(shù)對于豆類芽苗菜的開發(fā)具有重要意義。

小豆中的總黃酮類化合物（如槲皮素和兒茶素等）具有較強(qiáng)的抗氧化能力[14]。本研究結(jié)果也表明，小豆種子富含酚類化合物和黃酮類化合物，且具有較高的抗氧化特性（圖1、圖4）。本研究采用3種體外評(píng)價(jià)方法研究小豆種子及芽苗菜的抗氧化能力，小豆種子和芽苗菜的總酚類物質(zhì)含量均與DPPH呈顯著正相關(guān)關(guān)系，這表明酚類化合物的總量在抗氧化能力中起重要作用。蘇黑珠1號(hào)小豆種子的總酚類和總黃酮類化合物含量最高，抗氧化能力最強(qiáng)，因此蘇黑珠1號(hào)小豆種子最適宜開發(fā)抗氧化保健產(chǎn)品。蘇品紅1號(hào)和蘇黃1號(hào)小豆芽苗菜的總酚類和總黃酮類化合物含量是其相應(yīng)種子的 1.10～1.39倍，因此蘇品紅1號(hào)和蘇黃1號(hào)小豆可用于生產(chǎn)富含酚類和黃酮類化合物的小豆芽苗菜。

前期研究報(bào)道，深色種皮的豆類種子由于富含花青素等酚類物質(zhì)而具有較強(qiáng)的抗氧化性，因此更有利于緩解由氧化應(yīng)激反應(yīng)引起的疾病[15]。本研究也表明，與淺色種皮的種子相比，深色種皮的小豆種子（如蘇灰1號(hào)和蘇黑珠1號(hào)小豆）具有更高含量的酚類化合物和更強(qiáng)的抗氧化能力。此外，小豆種子總酚類物質(zhì)含量與抗氧化能力具有較好的相關(guān)性，這與Lin等的研究結(jié)果[15]一致。然而，小豆發(fā)芽后子葉不出土，因此造成種皮中色素的損失，最終引起小豆芽苗菜中酚類物質(zhì)含量和抗氧化能力下降。與此相反，部分淺色種皮的小豆芽苗菜總酚類物質(zhì)含量和抗氧化能力顯著高于其種子，這可能是由于淺色種皮的小豆芽苗菜對培養(yǎng)過程中的光環(huán)境更敏感，從而在光源下產(chǎn)生了更多的酚類代謝產(chǎn)物。

皂苷是豆類中的一種天然活性物質(zhì)，本研究發(fā)現(xiàn)，小豆種子是良好的皂苷來源。然而發(fā)芽會(huì)造成皂苷含量的損失，這與Guajardo-Flores等對大豆的研究結(jié)果[16]不一致。造成這種差異的原因可能是：一方面，皂苷主要存在于種臍中，小豆芽苗菜為子葉留土型芽苗菜，因此造成了芽苗中皂苷的大量損失[17];另一方面，浸種時(shí)種子中的皂苷可能被浸出，從而降低整體的皂苷水平[16]。γ-GABA是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，具有調(diào)節(jié)心率、降血壓和緩解壓力等生理功能。前期研究表明，發(fā)芽可顯著提高豆類的γ-GABA含量[18]，而發(fā)芽過程中的低氧和鹽脅迫等處理可進(jìn)一步提高大豆和蠶豆芽苗菜的γ-GABA含量[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，小豆種子的γ-GABA含量高于小豆芽苗菜，因此小豆種子可以作為γ-GABA的良好膳食來源。

綜上所述，蘇品紅1號(hào)和蘇黃1號(hào)小豆可用于生產(chǎn)富含酚類和黃酮類化合物的小豆芽苗菜。蘇黑珠1號(hào)小豆種子的功能性成分含量豐富、抗氧化能力最強(qiáng)，且蘇黑珠1號(hào)小豆芽苗菜的產(chǎn)量最高，因此蘇黑珠1號(hào)小豆既可以直接作為功能性食品的原料，也適合做小豆芽苗菜生產(chǎn)的原料，開發(fā)潛力較大。

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