楊磊,盛慧,張金鳳,田輝,張修國(guó)*,孫文秀*

本氏煙基因的克隆及初步功能分析

楊磊1,盛慧2,張金鳳2,田輝2,張修國(guó)2*,孫文秀1*

1. 長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 湖北 荊州 434025 2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 山東 泰安 271018

辣椒疫霉菌（）通過(guò)與植物互作調(diào)節(jié)植物的免疫反應(yīng)，進(jìn)而引起植物感病。前期實(shí)驗(yàn)證明辣椒疫霉效應(yīng)分子RxLR19781與本氏煙（）熱激蛋白90（NbHSP90）可以發(fā)生相互作用。利用RT-PCR技術(shù)從本氏煙中克隆得到基因，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)，驗(yàn)證在辣椒疫霉侵染本氏煙過(guò)程中的作用。研究結(jié)果表明：基因的cDNA序列全長(zhǎng)1005 bp，編碼含334個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，不含信號(hào)肽，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，具有典型的HATPase保守結(jié)構(gòu)域和C端基序MEEVD。瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果表明，能顯著減弱辣椒疫霉在本氏煙中的定殖。研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明辣椒疫霉效應(yīng)分子RxLR19781靶向本氏煙HSP90促進(jìn)自身侵染的分子機(jī)制提供了依據(jù)。

辣椒疫霉菌;本氏煙;基因克隆

疫霉菌屬于卵菌，是危害大豆、番茄、辣椒等經(jīng)濟(jì)作物的毀滅性病原菌。在侵染寄主植物的過(guò)程中，通過(guò)分泌效應(yīng)分子與寄主靶標(biāo)蛋白互作，進(jìn)而操控寄主的代謝反應(yīng)與防御機(jī)制，以促進(jìn)自身的侵染[1]。這些效應(yīng)分子分為細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)分子和質(zhì)外體效應(yīng)分子，其中細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)分子中包含一類(lèi)具有N端信號(hào)肽和RxLR（R:精氨酸; x:任意氨基酸; L:亮氨酸; R:精氨酸）保守基序的RxLR效應(yīng)分子，可以靶向寄主不同亞細(xì)胞位置的正負(fù)調(diào)控因子，干擾其正常的生理過(guò)程，從而有利于病原物的侵染[2]。如辣椒疫霉（）的RxLR效應(yīng)分子PcAvr3a12通過(guò)靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶（PPIase）FKBP15-2，降低其PPIase的活性，從而抑制寄主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，促進(jìn)辣椒疫霉的侵染[3]。大豆疫霉（）的PsAvh240通過(guò)在質(zhì)膜處阻止天冬氨酸蛋白酶GmAP1分泌到質(zhì)外體中，導(dǎo)致寄主的抗性減弱[4]。蕓薹疫霉（）效應(yīng)分子RxLR3可以與胞間連絲處的胼胝質(zhì)合成酶CaIS互作來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞間的電導(dǎo)率，減少胼胝質(zhì)的積累，抑制寄主的防衛(wèi)反應(yīng)[5]。

熱激蛋白90（Heat shock protein 90, HSP90）是一類(lèi)在植物中廣泛存在且高度保守的分子伴侶，通常以同源二聚體的形式存在[6]。HSP90存在于在植物細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，主要由N末端ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域、中間域以及具有五肽MEEVD序列的C端二聚結(jié)構(gòu)域3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成[7,8]。當(dāng)植物受到自然環(huán)境中各種生物或非生物脅迫時(shí)，HSP90可以通過(guò)參與調(diào)節(jié)和維持植物細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)的構(gòu)象與功能，從而防止細(xì)胞受損并維持植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育[9]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)小麥或基因的沉默會(huì)導(dǎo)致小麥對(duì)小麥條銹病的抗性減弱[10]。大豆轉(zhuǎn)基因擬南芥可以減少應(yīng)對(duì)非生物脅迫時(shí)受到的細(xì)胞損傷，并維持?jǐn)M南芥的正常生長(zhǎng)發(fā)育[11]。擬南芥胞質(zhì)HSP90被報(bào)道參與了免疫受體NLR復(fù)合物的組裝、穩(wěn)定性控制與激活，還參與調(diào)節(jié)適當(dāng)水平的免疫受體蛋白以避免自身免疫[12]。盡管HSP90是植物免疫不可或缺的組成部分，但是目前對(duì)疫霉菌靶標(biāo)植物HSP90的致病機(jī)制仍少有報(bào)道。

實(shí)驗(yàn)室前期利用酵母雙雜交、免疫共沉淀和雙分子熒光等技術(shù)已證明辣椒疫霉效應(yīng)分子RxLR19781可以與本氏煙熱激蛋白90（NbHSP90）發(fā)生相互作用。本研究從本氏煙中克隆得到基因，利用生物信息學(xué)技術(shù)分析其序列特征，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)在本氏煙中過(guò)表達(dá)NbHSP90，再進(jìn)行致病性接種測(cè)定，研究結(jié)果為驗(yàn)證NbHSP90的功能以及RxLR19781在辣椒疫霉致病過(guò)程的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌感受態(tài)DH5α、農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，植物表達(dá)載體pBIN-GFP2由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院竇道龍教授惠贈(zèng)。試驗(yàn)菌株辣椒疫霉菌LT1534及空載GFP農(nóng)桿菌保存于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院真菌資源與利用研究室，

試驗(yàn)植株本氏煙（）種植于本實(shí)驗(yàn)室25 ℃恒溫溫室，交替于光照16 h，黑暗8 h下培養(yǎng)。

1.2 RNA提取與cDNA合成

收取3-4周齡的本氏煙葉片，按照OMEGA公司的Total RNA Kit I試劑盒說(shuō)明書(shū)提取本氏煙的總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提總RNA的質(zhì)量。若樣品OD260/OD280值在1.8~2.0之間，則按照南京諾唯贊公司的HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成樣品cDNA。

1.3 基因克隆與載體構(gòu)建

在本氏煙基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https://solgenomics.net/tools/blast/）中BLAST檢索的基因序列。根據(jù)ClonExpress II One Step Cloning Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)計(jì)特異性引物NbHSP90-F(5'-cctccatggggatccggtaccATGGCGGACACAGAAACCTTT-3')/NbHSP90-R（5'-tgtcttcgggacatgcccggg ATCGACTTCTTCCATCTTGCTGC-3'），以本氏煙cDNA為模板，擴(kuò)增目的基因，利用限制性?xún)?nèi)切酶I及Ⅰ將目的載體pBIN-GFP2線性化，配制重組反應(yīng)體系：線性化pBIN-GFP2載體1 μL，基因8 μL，5×CE II Buffer 4 μL，Exnase II 2 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL。37 ℃反應(yīng)30 min。反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，陽(yáng)性克隆測(cè)序正確后提取質(zhì)粒即得重組表達(dá)載體 pBINGFP2:。

1.4 生物信息學(xué)分析

通過(guò)Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/search)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)確認(rèn)蛋白質(zhì)家族；使用ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)；利用SignalP4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)預(yù)測(cè)信號(hào)肽；TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)用于預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)。

1.6 基因瞬時(shí)表達(dá)與功能檢測(cè)

將重組表達(dá)載體 pBINGFP2:通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，挑單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基（Rif，Kana 50 μg/μL）中，28 ℃振蕩培養(yǎng)20 h，離心（3800 rpm，5 min）收集菌體，適量10 mM MgCl2洗滌菌體3次，重懸于緩沖液（10 mM MES, 10 mM MgCl2, and 200 mM AS）并調(diào)節(jié)OD600值至0.5左右。28 ℃靜置培養(yǎng)3~4 h，在至少15片4~6周齡的本氏煙葉片兩側(cè)分別接種含pBINGFP2:NbHSP90或pBIN-GFP2的GV3101懸浮液，24 h后接種辣椒疫霉游動(dòng)孢子，兩天后紫外燈下記錄葉片癥狀[13]。

1.7 Western blot分析

選取利用農(nóng)桿菌分別瞬時(shí)表達(dá)NbHSP90和GFP的本氏煙葉片提取總蛋白，SDS-PAGE分離總蛋白，再利用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，經(jīng)一抗鼠Anti-GFP（1:3000）和兔抗鼠二抗（1:10000）依次孵育后，ECL顯色檢測(cè)蛋白的表達(dá)。具體步驟參考Huang等[14]。

1.8 DNA提取與q-PCR檢測(cè)

在本氏煙葉片上瞬時(shí)表達(dá)NbHSP90和GFP后接種辣椒疫霉游動(dòng)孢子，48 h后分別收取樣品，利用CTAB法提取基因組DNA，具體方法參照Li等[15]。用本氏煙基因（）和辣椒疫霉基因（）設(shè)計(jì)q-PCR特異性引物（表1），以所提DNA為模板，本氏煙作為持家基因，依據(jù)ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix (Low ROX Premixed)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行q-PCR檢測(cè)。相對(duì)生物量通過(guò)來(lái)計(jì)算，具體操作參考Li等[16,17]

表 1 定量 PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 本氏煙NbHSP90基因的克隆與分析

以本氏煙cDNA為模板，使用高保真聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，目的條帶大小與預(yù)期片段大小基本一致。經(jīng)測(cè)序比對(duì)，NbHSP90的基因序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列相符，結(jié)果表明，基因的全長(zhǎng)cDNA序列為1005 bp，編碼334個(gè)氨基酸。

圖 1 本氏煙NbHSP90基因的克隆

M: DL2000 Plus DNA Marker; 1, 2:

圖2 本氏煙中NbHSP90的Western blot檢測(cè)

通過(guò)在線生物信息學(xué)軟件分析NbHSP90的氨基酸序列特征。由Pfam和SMART分析表明，NbHSP90屬于HSP90蛋白家族，具有高度保守的N端ATPase結(jié)構(gòu)域和C端MEEVD五肽序列。ProtParam預(yù)測(cè)顯示，蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為37.385 kD，理論等電點(diǎn)為4.60。SignalP和TMHMM分析可知，NbHSP90蛋白不含信號(hào)肽，無(wú)跨膜區(qū)。

2.2 本氏煙中NbHSP90的表達(dá)檢測(cè)

為了驗(yàn)證重組表達(dá)載體pBINGFP2:是否能在本氏煙中正確表達(dá)，通過(guò)Western blot技術(shù)檢測(cè)了NbHSP90和GFP的表達(dá)情況。如圖所示（圖2），NbHSP90和GFP的蛋白大小與預(yù)期大小一致，結(jié)果表明，NbHSP90和GFP均能在本氏煙葉片中正確表達(dá)，可以用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 NbHSP90在辣椒疫霉侵染過(guò)程中的功能鑒定

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)，在本氏煙葉片兩側(cè)分別表達(dá)NbHSP90和GFP，并接種辣椒疫霉游動(dòng)孢子，48 h后紫外燈下觀察葉片感染情況，記錄病斑直徑并拍照。結(jié)果顯示（圖3），以GFP作為對(duì)照，本氏煙中接種NbHSP90處的病斑大小明顯小于對(duì)照處，這說(shuō)明NbHSP90能顯著抑制辣椒疫霉的侵染，過(guò)表達(dá)NbHSP90增強(qiáng)了本氏煙對(duì)辣椒疫霉的抗性。

圖 3 辣椒疫霉菌侵染過(guò)程中NbHSP90的功能分析

A: NbHSP90功能驗(yàn)證; B: 病斑直徑統(tǒng)計(jì); 誤差線表示SD,<0.01

A: Function analysis of NbHSP90; B: Statistics analysis of lesion diameter; Error bars are SD,<0.01

2.4 辣椒疫霉菌生物量的檢測(cè)

在感染辣椒疫霉的本氏煙葉片中，分別提取接種NbHSP90和GFP本氏煙葉片的基因組DNA，以接種GFP作為對(duì)照，通過(guò)q-PCR檢測(cè)，以辣椒疫霉的基因和本氏煙的基因來(lái)定量分析感染植物組織的生物量。

圖4 辣椒疫霉菌的定量分析

A: 溶解曲線; B: 辣椒疫霉的相對(duì)生物量; 誤差線表示SD,<0.01

A: Real-time fluorescence quantitative standard curve; B: Relative biomass of; Error bars are SD,<0.01

結(jié)果如圖所示（圖4），相對(duì)于接種GFP處感染的生物量，辣椒疫霉在NbHSP90處的定殖顯著減少。這表明NbHSP90在植物應(yīng)對(duì)辣椒疫霉侵染的過(guò)程中充當(dāng)免疫正調(diào)控因子。

3 討 論

HSP90在ATP驅(qū)動(dòng)下與真核細(xì)胞不同發(fā)育階段的蛋白協(xié)同作用，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，蛋白質(zhì)折疊和形態(tài)演變。其中能與HSP90發(fā)生相互作用的蛋白主要分為三種類(lèi)型，包括輔助蛋白，調(diào)節(jié)因子以及底物蛋白[7]。輔助蛋白與調(diào)節(jié)因子通過(guò)調(diào)節(jié)HSP90與底物蛋白之間的相互作用產(chǎn)生不同的生理活性。近來(lái)越來(lái)越多的研究表明，HSP90在植物的生長(zhǎng)發(fā)育，脅迫應(yīng)答和病蟲(chóng)害免疫中起到關(guān)鍵性作用[8]。因此，深入探討植物HSP90的功能有助于理解脅迫信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵脅迫相關(guān)基因，進(jìn)一步為植物的遺傳育種提供基因資源。

在植物與病原菌的協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，HSP90通過(guò)介導(dǎo)植物免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與先天免疫受體和蛋白激酶的活化與穩(wěn)定，因而成為植物免疫的重要組成成分[18]。病原菌為克服宿主的防御反應(yīng)，分泌大量的效應(yīng)分子靶向免疫信號(hào)通路的正負(fù)調(diào)節(jié)因子，從而營(yíng)造出有利于自身定殖的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。丁香假單胞桿菌（）的效應(yīng)分子HopBF1可以使宿主的HSP90發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致其N(xiāo)端ATPase活性失活，進(jìn)而干擾免疫受體NB-LRR活化來(lái)抑制植物的免疫反應(yīng)[19]。但在疫霉屬卵菌中，有關(guān)效應(yīng)分子直接靶向寄主HSP90以促進(jìn)自身侵染的報(bào)道相對(duì)較少。因此驗(yàn)證NbHSP90在辣椒疫霉致病過(guò)程中的作用，有助于闡明辣椒疫霉效應(yīng)分子RxLR19781靶向本氏煙NbHSP90的致病機(jī)制。

在本研究中，成功克隆得到能與辣椒疫霉RxLR19781發(fā)生互作的NbHSP90的cDNA序列，并通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，NbHSP90是高度保守的HSP90蛋白家族成員，不含信號(hào)肽，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)，在本氏煙中成功瞬時(shí)過(guò)表達(dá)NbHSP90，并接種辣椒疫霉進(jìn)行致病性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NbHSP90能顯著抑制辣椒疫霉在本氏煙中的定殖，這說(shuō)明NbHSP90對(duì)于防御辣椒疫霉菌至關(guān)重要，在植物免疫過(guò)程充當(dāng)正向調(diào)控因子。但對(duì)于辣椒疫霉效應(yīng)分子RxLR19781如何靶向植物免疫正調(diào)控因子NbHSP90以促進(jìn)自身侵染的分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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Cloning and Primary Functional Analysis ofGene from

YANG Lei1, SHENG Hui2, ZHANG Jin-feng2, TIAN Hui2, ZHANG Xiu-guo2*, SUN Wen-xiu1*

1.434025,2.271018,

pathogen interacts with plant to manipulate plant immune responses and promote infection. Previous experiments demonstrated that the effector RxLR19781 ofcould interact with heat shock protein 90 (NbHSP90) of.was cloned fromby RT-PCR. NbHSP90 of transient expression mediated byonto explore the role of NbHSP90 in the pathogenesis of. The results showed that the full-length cDNA ofwas 1005 bp, encoding a protein with 334 amino acids, no signal peptide, no transmembrane structure, with typical conserved HATPase domain and C-terminal MEEVD motif. The results of transient expression illustrated that NbHSP90 could significantly reduce the colonization ofon. The results provide a basis for further elucidating the molecular mechanism of RxLR 19781 targeting HSP90 to promote infection.

;; gene cloning

R379

A

1000-2324(2021)02-0163-05

10.3969/j.issn.1000-2324.2021.02.001

2021-01-29

2021-02-13

國(guó)家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-25-03B)

楊磊(1995-),男,在讀碩士生,研究方向:細(xì)胞生物學(xué). Email:2524422614@qq.com

Author for correspondence. E-mail:zhxg@sdau.edu.cn; wenxiusun@163.com