萬云寶, 陳宇紅, 蔣學(xué)飛, 朱芮佳, 魏 濤, 王茂林

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 教育部生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 成都 610065)

1 引 言

植物真菌病害是造成農(nóng)產(chǎn)品損耗的主要原因之一，在實(shí)際生產(chǎn)中造成了不可估量的經(jīng)濟(jì)損失. 病原菌侵染植株后，使農(nóng)作物局部或整株感病，影響作物生長，嚴(yán)重時(shí)造成植株死亡，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量降低，品質(zhì)下降. 多數(shù)病原菌不僅能在作物生長過程中影響植株?duì)顟B(tài)，還在農(nóng)產(chǎn)品的運(yùn)輸過程中造成產(chǎn)品腐爛變質(zhì)，是造成果蔬運(yùn)輸損耗的主要原因[1]. 此外，部分真菌病原菌能夠分泌真菌毒素，食用含有真菌毒素的果蔬能夠?qū)е禄セ蛘T發(fā)癌癥，威脅人類健康. 如多種鏈格孢產(chǎn)生的鏈格孢毒素[2]以及多種曲霉產(chǎn)生的伏馬霉素B[3-4].

幾丁質(zhì)，是由N-乙酰基-D-葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine, GlcNAc)單體通過β-1,4-糖苷鍵連接的聚合物，也是病原真菌細(xì)胞壁的主要成分. 在絲狀真菌中，幾丁質(zhì)和其他葡聚糖含量占細(xì)胞壁成分的70%以上[5]，在部分酵母中，幾丁質(zhì)含量甚至達(dá)到細(xì)胞干重的10%～20%[6-7]. 幾丁質(zhì)酶可以通過外切和/或內(nèi)切水解酶作用將幾丁質(zhì)裂解為GlcNAc或GlcNAc的可溶性寡聚體. 因此，以幾丁質(zhì)作為分子靶標(biāo)，通過幾丁質(zhì)酶的水解作用來實(shí)現(xiàn)植物病害防治是植物病害控制的有效途徑. 而生物防治因子分泌細(xì)胞壁裂解酶，裂解病原真菌細(xì)胞壁，也成為生物防治微生物拮抗植物病原真菌的主要機(jī)制之一[1,8].

煙管菌(Bjerkanderaadusta)屬于非褶菌目，多孔菌科，煙管菌屬. 目前，對于煙管菌(Bjerkanderaadusta)的研究主要集中在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域[9-10]，但仍不乏煙管菌對植物真菌病害治理的研究報(bào)道. 1982年，Dománski[11]發(fā)現(xiàn)煙管菌能夠抑制櫟樹(Quercusrobur)褐腐病的發(fā)生. 2011年，Bak等[12]研究發(fā)現(xiàn)了煙管菌對歐美黑楊(Populuseuramericana)干腐病具有防控能力；2015年，汪華等人[13]篩選出一株對水稻紋枯病菌或瓜亡革菌(Thanatephoruscucumeris)、大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)、茄科羅爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)等引起的植物病害具有很好防治效果的煙管菌M-1；2017年，Zhang等人[14]研究發(fā)現(xiàn)煙管菌能夠有效的抑制西瓜蔓枯病菌(Didymellabryoniae)，并在2018年首次探究了煙管菌對核盤菌的抑制作用及其對油菜菌核病(Sclerotiniasclerotiorum)的防治效果[15]. 但目前，仍然缺乏煙管菌生物防治機(jī)制研究. 本研究結(jié)合抗病效果和RT-qPCR分析，首次從煙管菌中篩選并克隆出一個(gè)幾丁質(zhì)酶基因，并通過外源表達(dá)證明了該酶的抗真菌活性. 推測該基因是煙管菌發(fā)揮生防作用過程中的細(xì)胞壁裂解酶基因.

2 材料與方法

2.1 材 料

本氏煙(Nicotianabenthamiana).

煙管菌(Bjerkanderaadusta)菌株BK-1從四川省馬爾康市土壤中獲得，保藏于本實(shí)驗(yàn)室，ITS序列號(hào)為MW182414(NCBI). 鏈格孢(Alternariaalternata)菌株CD-1，鏈格孢蘋果?；?Alternariaalternataf. sp.mali)L-1，細(xì)極鏈格孢(Alternariatenuissima)SCAU-1和灰葡萄孢(Botrytiscinerea)DY-1均為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種.尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)(BNCC NO. 143078)，茄鏈格孢(Alternariasolani)(BNCC NO. 337910)購自北納生物(BeNa Culture Collection，BNCC).

PCR引物見表1及表2.

表1 細(xì)胞壁裂解酶基因熒光定量PCR引物

表2 幾丁質(zhì)酶BaCHIB克隆引物

2.2 方 法

2.2.1 煙管菌抗病能力分析 將灰葡萄孢,鏈格孢和細(xì)極鏈格孢轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基中25 ℃活化培養(yǎng)7 d，使用直徑為5 mm的打孔器切取菌絲瓊脂塊作為接種物；煙管菌活化培養(yǎng)7 d后,將5個(gè)直徑為5 mm的煙管菌菌絲瓊脂塊接種至液體的100 mL PDB培養(yǎng)基中25 ℃，180 r/min活化培養(yǎng)7 d后使用粉碎機(jī)打碎，制成煙管菌菌絲懸液作為抗菌液(AntiL)備用.

離體實(shí)驗(yàn)：從生長30 d的煙草植株上剪取健康的煙草葉片流水沖洗10 min，使用保鮮膜封住葉柄切口處，放置于無菌水浸濕的三層濾紙上，在主葉脈兩側(cè)對稱位置分別涂抹50 μL無菌水和煙管菌菌絲懸液后接種病原菌菌絲瓊脂塊作為對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組6重復(fù). 再將葉片和濾紙放入上層開口的塑料盒中，上層使用保鮮膜封口保持盒內(nèi)濕潤. 將其置于溫室內(nèi)(23 ℃，16 h光照；18 ℃，8 h黑暗)，保持48 h(細(xì)極鏈格孢侵染96 h)后對煙草葉片進(jìn)行拍照記錄.

活體實(shí)驗(yàn)：選取健康的煙草植株，將從上至下第4片葉片作為接種對象，接種方法同離體實(shí)驗(yàn).將接種后的植株放置在密閉，透光且濕潤的育苗盆內(nèi)，溫室培養(yǎng)48 h(細(xì)極鏈格孢侵染96 h)后拍照記錄.

上述實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)兩次，并使用ImageJ進(jìn)行葉片感病面積統(tǒng)計(jì).

2.2.2 生物信息學(xué)分析 參考該菌株基因組相關(guān)信息(NCBI BioProject ID: PRJNA667319)，使用SignalP v5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對其幾丁質(zhì)酶基因和β-1,3-糖苷酶基因進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測；并在NCBI數(shù)據(jù)庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對幾丁質(zhì)酶的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比對.

2.2.3 對峙培養(yǎng)及RT-qPCR分析 將6種病原真菌和煙管菌接種到PDA培養(yǎng)基中，25 ℃避光條件下活化培養(yǎng)5 d，使用打孔器取各菌落邊緣處直徑為5 mm的菌塊. 分別將煙管菌和一種病原菌接種到新的PDA培養(yǎng)基中，各距離平板邊緣2 cm，并使兩菌塊保持在同一直徑線上. 25 ℃避光培養(yǎng).

使用真菌RNA快速抽提試劑盒(生工)，提取對峙培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中接種后第6 d相互接觸區(qū)域菌絲的RNA，使用EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(全式金)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA.以cDNA為模板，以18S rRNA作為參考基因，使用2× T5 Fast qPCR Mix(SYBRGreenII)試劑盒(擎科)對預(yù)測具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的幾丁質(zhì)酶基因和β-1,3-糖苷酶基因進(jìn)行表達(dá)量測定.

2.2.4 煙管菌幾丁質(zhì)酶基因BaCHIB克隆 使用高保真酶1-5TM2× Hight-Fidelity Master Mix(MCLAB)擴(kuò)增去除信號(hào)肽區(qū)段的幾丁質(zhì)酶基因BaCHIB-T，并在C端添加6×His蛋白純化標(biāo)簽. 以煙管菌cDNA為初始模板，后續(xù)PCR過程依次使用上一步擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，得到目的片段BaCHIB-T，具體引物如下：①. BaCHIB-Cl-F/R；②. BaCHIB-Cl-F和His1-R；③. BaCHIB-Cl-F和His2-R；④.EcoRⅠ-T-F和NotⅠ-R.

使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotI處理載體pPIC9K. 利用同源重組試劑盒(諾唯贊)將BaCHIB-T與線性化的載體同源重組得到重組載體pPIC9K-BaCHIB-T(圖1)，測序正確的表達(dá)載體使用限制性內(nèi)切酶salⅠ線性化，醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[16]轉(zhuǎn)化畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115菌株.

圖1 重組載體pPIC9K-BaCHIB-T結(jié)構(gòu)

2.2.5 重組蛋白的表達(dá)和純化及抗真菌活性 蛋白的表達(dá)和純化按照Deng等[17]的方法進(jìn)行，并進(jìn)行改進(jìn). 重組載體的表達(dá)菌株經(jīng)0.5%的甲醇誘導(dǎo)5 d，相同處理的空載轉(zhuǎn)化菌株用于對照組. 依次使用含有80，100，120，140 mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗脫與柱結(jié)合的目標(biāo)蛋白. 目的條帶經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測. 幾丁質(zhì)酶活性測定使用幾丁質(zhì)酶活性檢測試劑盒(索萊寶).

純化后的重組蛋白，濃度調(diào)整為200 μg/mL進(jìn)行抗真菌活性檢測. 從活化5 d的鏈格孢，茄鏈格孢和灰葡萄孢的平板邊緣切取兩塊邊長約為5～10 mm的正方形菌絲瓊脂塊，并將其置于2 mL離心管中. 每管加入400 μL純化蛋白溶液作為實(shí)驗(yàn)組，等量蛋白洗脫液作為對照組. 25 ℃暗培養(yǎng)48 h后，觀察菌絲生長狀況.

3 結(jié)果與分析

3.1 煙管菌的抗病能力分析

以煙草為寄主，檢驗(yàn)煙管菌對由灰葡萄孢引起的灰霉病，由鏈格孢引起的赤星病和黑斑病的抑制效果進(jìn)行抗病表型實(shí)驗(yàn)(表3). 結(jié)果表明，在離體和活體條件下，煙管菌能夠使灰霉病病斑面積分別減少91.97%和100%；使赤星病病斑面積減少77.12%和75.03%. 而在黑斑病的實(shí)驗(yàn)組中，離體條件下并未觀察到明顯的抗病效果；活體接種病原菌時(shí)，多次重復(fù)未檢測到明顯發(fā)病跡象.

表3 煙管菌對煙草真菌病害的抗病能力

煙草灰霉病、煙草赤星病和煙草黑斑病分別由灰葡萄孢、鏈格孢和細(xì)極鏈格孢引起.煙草葉片的病斑面積測量后，被用以比較煙管菌對上述三種病害的抗病能力.數(shù)據(jù)使用單因素方差分析，“*”表示差異顯著(P< 0.001).

3.2 生物信息學(xué)分析

對該菌株的基因組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)煙管菌該菌株具有11個(gè)幾丁質(zhì)酶基因，12個(gè)β-1,3-糖苷酶基因. 其中5個(gè)幾丁質(zhì)酶基因(EVM0010419;EVM0005032;EVM0003995;EVM0003825;EVM0009013)和3個(gè)β-1,3-糖苷酶基因(EVM0006890;EVM0003791;EVM00010135)所對應(yīng)的蛋白序列N端具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu). 煙管菌幾丁質(zhì)酶基因的保守結(jié)構(gòu)域分析表明，煙管菌幾丁質(zhì)酶基因均屬于GH 18基因家族. 此外，EVM0005032和EVM0003825末端帶有Chic_BD(aromatic chitin/cellulose binding site residues)結(jié)構(gòu)，屬于B類幾丁質(zhì)酶(CHIB).

3.3 幾丁質(zhì)酶基因和β-1,3-糖苷酶基因的表達(dá)譜分析

RT-qPCR分析對峙培養(yǎng)第6 d的煙管菌細(xì)胞壁裂解酶基因的表達(dá)水平. 結(jié)果表明在該階段，多個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)，如幾丁質(zhì)酶基因EVM0005032，EVM0003825和EVM0009013，β-1,3-糖苷酶基因EVM0006890(圖2). 尤其是幾丁質(zhì)酶基因EVM60005032(BaCHIB)，在與鏈格孢、茄鏈格孢、灰葡萄孢和尖孢鐮刀菌的對峙培養(yǎng)時(shí)，該基因分別上調(diào)表達(dá)27.3倍、31.7倍、50.3倍和41.3倍(圖2B)，但在與鏈格孢蘋果?；秃图?xì)極鏈格孢相互作用時(shí)，該基因未發(fā)生相應(yīng)的上調(diào)表達(dá). 總體上來看，除基因EVM0005032外，其它基因上調(diào)的情況主要集中在煙管菌與茄鏈格孢和尖孢鐮刀菌的對峙培養(yǎng)中. 如基因EVM0009013和EVM0006890在應(yīng)對茄鏈格孢時(shí)表達(dá)上調(diào)(圖2e,2f). 另外，同屬B類幾丁質(zhì)酶基因的EVM0003825僅在與尖孢鐮刀菌的對峙培養(yǎng)中出現(xiàn)明顯的上調(diào)表達(dá)(圖2d).

圖2 接種6d后煙管菌預(yù)測具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的細(xì)胞壁裂解酶基因相對表達(dá)量分析

3.4 幾丁質(zhì)酶BaCHIB的抗真菌活性

使用鎳柱對重組蛋白BaCHIB進(jìn)行了分離純化，在咪唑濃度為80 mmol/L時(shí)目的蛋白能被高效洗脫，并在后續(xù)的SDS-PAGE中顯示為單一條帶(圖3). 大小在50～70 kD之間，與預(yù)測分子大小63.6 kD相近. 對純化后的重組蛋白進(jìn)行活性測定，在37 ℃下幾丁質(zhì)酶活性約為17.7 U/mg.

圖3 重組蛋白BaCHIB的純化

對幾丁質(zhì)酶BaCHIB進(jìn)行抗真菌活性測試，經(jīng)48 h溫育，相較于對照組，添加BaCHIB的實(shí)驗(yàn)組中，鏈格孢、茄鏈格孢和灰葡萄孢均無新生菌絲生長的痕跡，表現(xiàn)出明顯的生長抑制作用.

將煙管菌單獨(dú)培養(yǎng)作為對照組；A1為鏈格孢;A2為鏈格孢蘋果?；?A3為茄鏈格孢;A4為細(xì)極鏈格孢;B灰葡萄孢;F為尖孢鐮刀菌.根據(jù)多重比較結(jié)果，不同字母表示差異顯著(P≤ 0.05).

Fig.2 Relative expression levels of cell-wall lyase genes with a signal peptide at 6 days after inoculation (DAI)

CK isBjerkanderaadustaonly;A1 isAlternariaalternata;A2 isAlternariaalternataf. sp.mali;A3 isAlternariasolani;A4 isAlternariatenuissima;BisBotrytiscinerea;FisFusariumoxysporum. Different letters show significant differences based on Duncan’s Multiple Range Test (P≤ 0.05).

4 討 論

本研究通過離體和活體實(shí)驗(yàn)，證明了煙管菌對煙草灰霉病和赤星病具有良好的抗病效果. 但在煙草黑斑病的離體侵染4 d后，煙管菌施用與否對發(fā)病面積并無明顯影響，說明在離體條件下煙管菌對煙草黑斑病沒有抗病效果，而在活體實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組和對照組均無病斑的發(fā)生，該現(xiàn)象可能由于使用的細(xì)極鏈格孢菌株侵染能力較弱，導(dǎo)致侵染后無感病表型出現(xiàn).

生防微生物通過分泌細(xì)胞壁裂解酶抑制病原菌的生長是其發(fā)揮生防作用的主要機(jī)制之一，如幾丁質(zhì)酶，β-1,3-糖苷酶，脂肪酶和蛋白酶，這些酶體通常在破壞病原體的細(xì)胞壁中起著至關(guān)重要的作用. 為了初步探究煙管菌細(xì)胞壁裂解酶在煙管菌抗病中的作用，本研究通過生物信息學(xué)和RT-qPCR的角度出發(fā)，對煙管菌部分細(xì)胞壁裂解酶進(jìn)行分析.

GH 18家族廣泛存在于原核生物，真核生物乃至病毒中. 按照結(jié)構(gòu)域差異可分為兩大類[18]：Class III(B類)和Class V(A類). 其中B類幾丁質(zhì)酶含有幾丁質(zhì)或多糖結(jié)合位點(diǎn)，這類幾丁質(zhì)酶主要參與真菌生長發(fā)育過程中的營養(yǎng)吸收，并在線蟲和部分真菌寄生昆蟲的過程中發(fā)揮重要作用[18-21]. 此外，該類幾丁質(zhì)酶基因結(jié)構(gòu)與植物幾丁質(zhì)酶基因相似，而后者通常與寄主植物對病原細(xì)菌，真菌及線蟲的抗性相關(guān)[22-24]. 由此可推測，煙管菌幾丁質(zhì)酶基因EVM0005032(BaCHIB)和EVM0003825可能在煙管菌對病原真菌的生物防治中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用.

圖4 重組幾丁質(zhì)酶BaCHIB的抗真菌活性

使用RT-qPCR對預(yù)測具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的幾丁質(zhì)酶基因和β-1,3-糖苷酶基因的表達(dá)譜進(jìn)行分析測定，借此篩選出可能具有抗真菌活性的細(xì)胞壁裂解酶基因. 在對峙培養(yǎng)過程中，多個(gè)基因在接種6 d后表達(dá)量上調(diào)，特別是，幾丁質(zhì)酶基因EVM0005032. 結(jié)果表明部分植物真菌性病原，如鏈格孢，茄鏈格孢，尖孢鐮刀菌和灰葡萄孢，能夠直接誘導(dǎo)煙管菌細(xì)胞壁裂解酶基因的表達(dá). 這一結(jié)果與Banani等[25]的研究相似，桃梅奇酵母(Metschnikowiafructicola)菌株AP47在桃褐腐病菌(Moniliniafructicola)細(xì)胞壁提取物誘導(dǎo)下，其幾丁質(zhì)酶基因MfChi上調(diào)表達(dá)14倍，并在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出對桃子褐腐病的顯著抑制能力. 此外，Essghaier等[26]在研究一種嗜鹽菌對草莓灰霉病的防治過程中，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌能夠分泌多種具有抗真菌活性的酶類：幾丁質(zhì)酶，β-1,3-糖苷酶，纖維素酶和蛋白酶；Urbina等[27]在其研究中也發(fā)現(xiàn)橄欖假絲酵母分泌的一種β-1,3-糖苷酶對蘋果病原菌擴(kuò)展青霉具有拮抗能力. 上述研究為煙管菌幾丁質(zhì)酶BaCHIB具有抗真菌活性的假設(shè)提供了相應(yīng)的依據(jù). 另一方面，同屬于B類幾丁質(zhì)酶的基因EVM0003825，僅在煙管菌與尖孢鐮刀菌的對峙培養(yǎng)中出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，而未出現(xiàn)類似于BaCHIB在應(yīng)對多種病原真菌時(shí)的高表達(dá)現(xiàn)象，這一結(jié)果說明，幾丁質(zhì)酶基因BaCHIB可能在應(yīng)對病原真菌具有一定的特異性.

結(jié)合抗病效果與幾丁質(zhì)酶基因BaCHIB的誘導(dǎo)表達(dá)分析，表明煙管菌對植物真菌病害抗病表現(xiàn)與BaCHIB的誘導(dǎo)表達(dá)情況的出現(xiàn)高度同步. 如煙管菌對煙草灰霉病和赤星病具有抗病能力，幾丁質(zhì)酶基因BaCHIB在與灰葡萄孢和鏈格孢的對峙培養(yǎng)中出現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)；對煙草黑斑病沒有顯著的抗病效果，BaCHIB不出現(xiàn)顯著的誘導(dǎo)表達(dá). 這一結(jié)果為幾丁質(zhì)酶基因BaCHIB在煙管菌的生物防治中發(fā)揮重要作用提供了又一關(guān)鍵證據(jù).

通過真核外源表達(dá)系統(tǒng)，煙管菌幾丁質(zhì)酶BaCHIB能夠被成功表達(dá)和純化. 并表現(xiàn)出幾丁質(zhì)酶活性和良好的抗真菌活性. 這一結(jié)果驗(yàn)證了幾丁質(zhì)酶BaCHIB具有抗真菌能力. 在Ahmed等[28]的研究中，綠色木霉幾丁質(zhì)酶在濃度為2.23 mg/mL時(shí)，對尖孢鐮刀菌培養(yǎng)5 d后的抑菌能力為45%；而另一種來自珊瑚球菌的幾丁質(zhì)酶，在濃度為0.15 mg/mL和0.75 mg/mL時(shí)，對稻瘟病菌分生孢子萌發(fā)抑制率分別在40%和10%左右[29]；而來源于哈茨木霉的幾丁質(zhì)酶Chit46，在濃度為3.9 μg/mL時(shí)，對灰葡萄孢培養(yǎng)5 d后的生長抑制能力為76%，表現(xiàn)出較上述兩種幾丁質(zhì)酶更為高效的抑菌能力[17].在本研究中，三種病原真菌在0.2 mg/mL的幾丁質(zhì)酶溶液中培養(yǎng)2 d后，新生菌絲生長被強(qiáng)烈抑制，證明煙管菌幾丁質(zhì)酶BaCHIB同樣具有較好的抗真菌能力.

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，具有生防能力的煙管菌BK-1可能是通過分泌幾丁質(zhì)酶BaCHIB實(shí)現(xiàn)其對一些植物真菌病害的抑制，但具體的生物防治機(jī)制，仍然需要在此基礎(chǔ)上進(jìn)行更加深入的研究.