降解AFB1的克雷伯氏菌分離、鑒定及降解機理初步研究

謝澳文，樊 磊，韓一鳴，李文靖，王 樂，張帥兵，呂揚勇

河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

黃曲霉毒素(aflatoxins, AFs)主要是由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的一種聚酮合酶類(PKS)次級代謝產(chǎn)物。目前已獲得鑒定的黃曲霉毒素有20多種，包括B、M等多個家族，其中AFB1具有較強毒性和致癌性，在食品中也最為常見[1-2]。長期攝入含有黃曲霉毒素的食物，可導(dǎo)致人體免疫力降低、肝功能損傷甚至誘發(fā)肝癌[3-5]。在一定的條件下，黃曲霉產(chǎn)生的AFB1常存在于玉米、花生等大宗農(nóng)產(chǎn)品中，由此造成的污染而導(dǎo)致的直接或間接經(jīng)濟損失非常嚴重。因此，深入研究黃曲霉毒素脫毒方法及其降解機理對于進一步研究制定有效策略保證食品安全和人體健康具有重要意義。

目前，黃曲霉毒素的去除手段主要包括：物理方法如紫外照射[6-7]、高溫處理、微波處理[8]、放射性元素[9]及電子束照射[10]、某些物質(zhì)吸附[11]等；化學(xué)方法如酸處理、堿處理和氧化劑處理等[12-13]。然而，理化去除黃曲霉毒素的方法雖然能夠去除AFB1，但存在成本高、有化學(xué)殘留以及影響食品營養(yǎng)價值等弊端[14-16]。因此，利用生物法去除黃曲霉毒素已成為目前的研究熱點之一，其機理是通過吸附作用或酶促反應(yīng)降解毒素從而達到脫毒的目的[17-20]。比如Liu等[21]研究發(fā)現(xiàn)假蜜環(huán)菌胞內(nèi)酶可將黃曲霉毒素轉(zhuǎn)化成環(huán)氧化物，并最終打開雙呋喃環(huán)從而脫毒；Afsharmanesh等[22]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌UTB1在細菌素的生物合成過程中能夠產(chǎn)生一種降解黃曲霉毒素的氧化還原酶，并對其降解基因進行了確證。在一定的條件下篩選得到降解酶的菌株，并通過發(fā)酵、分離純化脫毒酶的研究技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品、飼料等領(lǐng)域[23]。通過生物法去除黃曲霉毒素的過程高效且反應(yīng)是在溫和的條件下進行，對于食品中的營養(yǎng)物質(zhì)基本不會造成破壞或者只是極少破壞，因此應(yīng)用前景廣泛[24-25]。

作者選取自然界發(fā)霉的糧食、秸稈、牛糞以及土壤等樣品，通過分離獲得了多個具有降解黃曲霉毒素能力的菌株，通過薄板層析初步篩選出降解效果較好的菌株；通過發(fā)酵條件的優(yōu)化，篩選降解菌株的最優(yōu)培養(yǎng)基，對其發(fā)揮作用的降解酶進行質(zhì)譜鑒定；對降解產(chǎn)物萃取后，通過液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS/MS)獲得降解產(chǎn)物的分子量，推斷其可能的降解機理。

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)霉的花生、玉米、秸稈、土壤以及牛糞均采自鄭州郊區(qū)的農(nóng)田。Hormisch改良初篩培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基參考文獻[26-27]。其余培養(yǎng)基如下。

SC培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10.00、Glucose 5.00、K2HPO4·3H2O 0.10、KH2PO41.00、MnSO40.50、 MgSO4·7H2O 1.00，pH 7.0。

DJN培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10.00、酵母粉 5.00、K2HPO4·3H2O 0.10、KH2PO41.00、MnSO40.50、MgSO4·7H2O 1.00、牛肉膏 3.00,pH 7.0。

DPN培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.00、Glucose 5.00、K2HPO4·3H2O 0.10、KH2PO41.00、MnSO40.50、MgSO4·7H2O 1.00、牛肉膏 3.00，pH 7.0。

1.2 主要儀器與設(shè)備

1260型高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；熒光檢測器：島津公司；MicrOTOF-QII質(zhì)譜儀：布魯克公司；UV-3100型分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；恒溫搖床：上海一恒儀器有限公司；5810R 型離心機：Eppendorf。

1.3 方法

1.3.1 AFB1降解菌的初篩與復(fù)篩

將5 g樣品置于95 mL的無菌水中，加入玻璃珠，在室溫條件下，160 r/min振蕩1 h，獲得懸濁液，取300 μL涂布于Hormisch改良初篩培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，挑選在初篩培養(yǎng)基上生長良好的菌株進行劃線分離，劃線分離3次后，挑取單菌落保存至LB斜面?zhèn)溆谩?菌種復(fù)篩參考孫糧等[24]的方法。

氯仿萃取之后，通過薄層層析法初步判斷菌株發(fā)酵液的降解效果，高效液相色譜法測定降解率，篩選出降解效果最優(yōu)的菌株。

1.3.2 高效液相色譜檢測AFB1

樣品前處理方法：以氯仿作為萃取劑，采用分步萃取的方式連續(xù)萃取3次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，用甲醇將萃取出的降解產(chǎn)物溶解，按照國家標準[28]采用液相色譜檢測。

1.3.3 AFB1降解菌的鑒定

參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》[29]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[30]進行屬的鑒定。16 s rDNA基因擴增及PCR程序參考孫糧等[24]的方法。

將獲得的測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對，并在MEGA7中進行分析，計算相似性并采用Neighbor-Joining方法做系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.3.4 降解菌株最優(yōu)培養(yǎng)基的選擇

挑選降解效果較好的菌株在LB培養(yǎng)基中活化后分別接種于SC、DJN及DPN培養(yǎng)基中，重復(fù)1.3.2的步驟，通過HPLC對樣品中AFB1的含量進行檢測，并計算降解率。

1.3.5 降解AFB1成分分析

菌懸液及上清液的制備：取2 mL菌體發(fā)酵液，10 000 r/min離心2 min，收集上清液備用。菌體在無菌操作臺中使用無菌水清洗2次，并重懸于2 mL無菌水中制得菌懸液備用。

上清液處理：(1)上清液中加入終質(zhì)量濃度為0.01 g/mL蛋白酶K，室溫下處理1 h；(2)上清液加入終質(zhì)量濃度為0.01 g/mL SDS后處理6 h。分別在菌懸液，上清液，經(jīng)過蛋白酶K、SDS處理后的上清液中加入AFB1，按照1.3.1所述方法進行降解試驗并測定降解率。

1.3.6 不同培養(yǎng)基發(fā)酵上清液蛋白圖譜及差異蛋白鑒定

SDS-PAGE的分離膠與濃縮膠的濃度分別為15%與5%，通過SDS-PAGE比較不同降解率的發(fā)酵液上清液中蛋白圖譜的差異，篩選差異蛋白條帶，切膠后送北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心進行質(zhì)譜鑒定，詳細方法參考文獻[31]。

1.3.7 AFB1降解產(chǎn)物分析

以上清液加AFB1振蕩0 h作為空白對照，按照1.3.2的步驟進行降解試驗，在190～800 nm進行紫外全波長掃描，測定降解產(chǎn)物的紫外吸收波長。分別使用正丁醇、氯仿、乙酸乙酯等萃取劑對降解后的產(chǎn)物進行萃取，采用分步萃取的方式連續(xù)萃取3次，在55 ℃下進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，用甲醇將獲得的降解產(chǎn)物溶解，在190～800 nm進行紫外全波長掃描，并將含有降解產(chǎn)物的甲醇溶液用于質(zhì)譜檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選及鑒定

通過初篩從樣品中得到了46株降解株，對這些菌株進行AFB1降解試驗。結(jié)果顯示，從土壤中篩選出的N1菌株對AFB1有較好的降解效果，通過16S rDNA基因(圖1)及生理生化(表1)鑒定,結(jié)果表明該菌屬于克雷伯氏菌屬。

圖1 N1的系統(tǒng)發(fā)育進化樹

表1 菌株N1的生理生化試驗結(jié)果

2.2 降解AFB1最佳培養(yǎng)基篩選及降解成分分析

N1菌株在SC、DPN、DJN培養(yǎng)基中的發(fā)酵上清液對AFB1的降解率存在差異，分別為57%、36%、74%，因此，將DJN培養(yǎng)基確定為最佳培養(yǎng)基，在后續(xù)的降解試驗中采用該培養(yǎng)基進行發(fā)酵。

未處理的發(fā)酵上清液對黃曲霉毒素的降解率達到了74%，遠高于菌體懸液對黃曲霉毒素20%的降解率，表明N1菌株對黃曲霉毒素的降解能力以上清液為主，菌體的吸附作用存在但不明顯。在上清液經(jīng)過蛋白酶K、SDS處理后，對黃曲霉毒素的降解能力大幅度下降，分別為10.56%和0。由此推斷上清液中對黃曲霉毒素具有降解能力的物質(zhì)可能為胞外酶。

2.3 AFB1降解酶的初步推斷

3種培養(yǎng)基上清液對AFB1降解率不同，同時初步確定降解物質(zhì)為胞外蛋白，因此，通過SDS-PAGE電泳對胞外蛋白圖譜進行表征，考察不同培養(yǎng)基發(fā)酵上清液蛋白圖譜的差異，以期對目標酶作初步分析，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同培養(yǎng)基發(fā)酵上清液的蛋白圖譜

圖2表明，N1菌株在3種培養(yǎng)基的發(fā)酵上清液中胞外蛋白圖譜差異性不明顯，但在DJN培養(yǎng)基的發(fā)酵上清液中蛋白條帶的濃度相比SC與DPN稍高。通過比較發(fā)現(xiàn)，相比于另外2種培養(yǎng)基，23 kDa處蛋白條帶濃度較高且完整地分布在DJN發(fā)酵培養(yǎng)上清液中，因此選擇該分子量完整單一的①號條帶進行切膠回收，并送至北京華大蛋白質(zhì)研究中心進行質(zhì)譜鑒定。根據(jù)數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果，并結(jié)合已有文獻報道的黃曲霉毒素降解酶，綜合分析該條帶，初步推斷對應(yīng)的酶可能為Mn-超氧化物歧化酶(SodA)或NADH-醌氧化還原酶(NuoB)，在后續(xù)試驗中需要做進一步的蛋白分離鑒定，或者用基因克隆、異源表達等實驗手段確定其種類。

2.4 降解產(chǎn)物萃取及檢測

按照1.3.1的步驟進行降解試驗，降解結(jié)束后對降解體系進行紫外全波長掃描，結(jié)果顯示在波長為310 nm左右具有較強的紫外吸收峰(圖3a)。

圖3結(jié)果表明，氯仿和乙酸乙酯萃取產(chǎn)物的全波長掃描結(jié)果與整個降解體系不同，在310 nm左右沒有吸收峰(圖3b和3c)，只有正丁醇萃取的產(chǎn)物在該波長處具有較強紫外吸收峰，說明降解產(chǎn)物存在其中(圖3d)。

2.5 LC-MS/MS檢測降解產(chǎn)物的分子量

將正丁醇萃取液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，甲醇溶解后進行液質(zhì)聯(lián)用檢測，在負離子模式下甲醇及降解產(chǎn)物的粒子流如圖4所示。結(jié)果表明，甲醇溶液的粒子流背景噪聲較低，滿足測試要求，而正丁醇萃取產(chǎn)物則在保留時間為2.6 min有單一峰出現(xiàn)，其他雜質(zhì)峰不明顯。

對保留時間為2.6 min峰的物質(zhì)和可能的降解產(chǎn)物進行分析，結(jié)果見圖5。該峰對應(yīng)的二級質(zhì)譜圖(圖5a)顯示其分子量為241.1，根據(jù)碎片峰提示，推測該降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)式如圖5b所示。研究表明黃曲霉毒素結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)結(jié)構(gòu)相對比較穩(wěn)定，很難被破壞，而呋喃環(huán)上的 8、9 位雙鍵部位則容易被破壞，該功能雙鍵是黃曲霉毒素與蛋白和DNA形成等復(fù)合體的作用位點，也是導(dǎo)致基因突變和致癌的主要功能基團[32]。此外，文獻[20]報道黃曲霉的內(nèi)酯鍵、甲氧基和環(huán)戊烯酮也能夠被破壞，從而降低其毒性。降解之后的結(jié)構(gòu)式(圖5b)與黃曲霉毒素B1原始結(jié)構(gòu)相比，呋喃環(huán)上的 8、9 位雙鍵被破壞，這與文獻[21,24]報道的一致；除此之外12位的甲氧基也被去除，其進一步的結(jié)構(gòu)需要采用核磁共振來確定。

圖3 N1菌株發(fā)酵上清液降解黃曲霉毒素B1產(chǎn)物全波長掃描圖

圖4 降解產(chǎn)物負離子模式下粒子流圖

圖5 降解產(chǎn)物的二級質(zhì)譜圖及推測的結(jié)構(gòu)式

3 討論與結(jié)論

以黃曲霉毒素結(jié)構(gòu)類似物香豆素為唯一碳源，從土壤中篩選出一株對AFB1具有良好降解能力的菌株N1，經(jīng)過分子生物學(xué)鑒定為克雷伯氏菌屬。目前對AFB1具有降解能力的大部分是枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、乳酸菌等，而克雷伯氏菌屬報道相對較少，只有最近王威等[33]做過類似研究。研究發(fā)現(xiàn)該N1菌株在DJN發(fā)酵液中的上清液對AFB1降解效果最好，在37 ℃、72 h內(nèi)降解率為74%，初步分析其降解成分為胞外酶，胞外蛋白差異條帶的鑒定結(jié)果顯示：該酶可能為超氧化物歧化酶或者NADH -錕氧化還原酶，后期還需要對該蛋白進行異源表達、分離純化以及降解效果分析等以明確其種類。降解產(chǎn)物的分析結(jié)果表明，通過正丁醇萃取能夠獲得降解產(chǎn)物，表明通過胞外酶的作用，黃曲霉毒素結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，呋喃環(huán)上的 8、9 位雙鍵以及12位的甲氧基被破壞，降解產(chǎn)物的極性增大，親水性加強，LC-MS/MS結(jié)果顯示該降解產(chǎn)物的分子量為241.1，推測其呋喃環(huán)發(fā)生了變化，這與已有文獻報道的作用位點一致。本研究結(jié)果為進一步分離純化該胞外酶，繼而進行異源表達從而大規(guī)模獲取該蛋白并應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。