空腸彎曲菌多重毒力基因檢測方法的建立

聶文芳,宋 清,騰 軍,陳 偉

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)是人畜共生的食源性致病微生物,廣泛分布于自然界中,其感染途徑以食用生的、未熟透的禽肉和消毒不充分的牛奶為主[1-5]。人感染空腸彎曲菌后,最常見的會引起腸胃炎、腹瀉、發(fā)燒以及腹部絞痛,并伴隨有反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、肝炎、瑞特氏病和格林-巴利綜合征等免疫性損傷性疾病[6-9]。世界衛(wèi)生組織已將空腸彎曲菌引起的腸炎列為最常見的傳染病之一,我國國家食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)也將彎曲菌列為監(jiān)測對象。

細(xì)胞溶漲毒素(cytolethal distending toxin，CDT)是目前空腸彎曲菌分泌表達(dá)的唯一細(xì)胞毒素,cdt基因簇由cdtA、cdtB、cdtC串聯(lián)組成,且cdtB在細(xì)胞毒素的分泌過程中起著決定性的作用?？漳c彎曲菌作為引起腹瀉的主要細(xì)菌之一,建立有效的快速檢測空腸彎曲菌毒力基因的方法已經(jīng)成為控制該類感染性疾病的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的檢測方法不僅耗時(shí)費(fèi)力、且成本高,不適用于現(xiàn)場檢測[10-12]。

目前用于檢測空腸彎曲桿菌的方法主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)、ELISA、RT-PCR、PCR-ELISA和多重PCR等[13-22],其中適合大批量樣品檢測及血清學(xué)調(diào)查的主要是ELISA和RT-PCR方法。然而,現(xiàn)有的ELISA方法還不能對空腸彎曲桿菌腸炎做出準(zhǔn)確的診斷,RT-PCR方法雖然可以對空腸彎曲桿菌準(zhǔn)確檢測,但是由于其操作復(fù)雜,需要特異的引物、昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備和專業(yè)的實(shí)驗(yàn)人員而不能適應(yīng)現(xiàn)場快速檢測的要求。

本研究提出了膠體金免疫層析試紙條結(jié)合 PCR預(yù)擴(kuò)增的方法,利用雙修飾的引物經(jīng)預(yù)擴(kuò)增后得到兩端帶有識別物的雙鏈分子:一端與金標(biāo)抗體結(jié)合;另一端再與試紙條上的檢測線結(jié)合顯色。根據(jù)細(xì)菌濁度的大小在試紙條上會顯示出不同程度的顏色,其顏色強(qiáng)度可直接用肉眼觀察出來,以此來建立空腸彎曲菌毒力基因的快速檢測新方法,以提高空腸彎曲菌的檢測限,并達(dá)到短時(shí)快速檢測的要求。

此外,試紙條成本低廉,固定于卡片盒中,適用于大批量生產(chǎn)使用,可以很好地替代RT-PCR和ELISA等方法,應(yīng)用于大批量、大范圍的空腸彎曲桿菌腸炎病學(xué)的調(diào)查研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種及背景

實(shí)驗(yàn)所用菌株均來自于江蘇南京出入境檢驗(yàn)檢疫局,其中陽性對照為空腸彎曲菌,陰性對照為大腸桿菌O157∶H7、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌ATCC33847。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

電熱恒溫水浴鍋、PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像系統(tǒng)、恒溫培養(yǎng)箱和電泳儀等;蛋白酶K、鏈霉親和素、特異性的PCR引物、地高辛抗體和FITC抗體均購自上海生物工程有限公司;吸水墊、樣品墊、金標(biāo)墊和硝酸纖維素膜均購自上海捷寧生物有限公司。

特異性的PCR引物序列為:

mapA-F:5’-Dig-CTATTTTATTTTTGAGTGCTTGTG-3’,

mapA-R:5’-Biotin-GCTTTATTTGCCATTTGTTTTATTA-3’,

預(yù)期擴(kuò)增片段大小為589 bp;

cdtB-F:5’-FITC-CAGAAAGCAAATGGAGTGTT-3’,

cdtB-R:5’-Dig-AGCTAAAAGCGGTGGAGTAT-3’,

預(yù)期擴(kuò)增片段大小為620 bp。

1.2 方法

1.2.1 模板DNA的制備

取1 mL不同濁度的空腸彎曲菌菌液10 000g離心7 min,沉淀溶于700 μL裂解液,65 ℃水浴10 min,加入1/2體積的磁珠吸附液振蕩反應(yīng)10 min,磁性分離去上清,沉淀用70%乙醇清洗后烘干,再溶于TE緩沖液65 ℃水浴10 min,收集上清液即為所制備的DNA樣品,4 ℃保存?zhèn)溆肹23]。

1.2.2 普通PCR預(yù)擴(kuò)增

PCR預(yù)擴(kuò)增體系包括10×PCR buffer,MgCl2,dNTPs,特異性的引物,Taq DNA聚合酶,致病菌DNA模板及雙蒸水。PCR預(yù)擴(kuò)增條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,51～55 ℃退火45 s,72 ℃延伸30 s,共35個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸2 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于2.0%瓊脂糖凝膠中,電泳觀察擴(kuò)增條帶。剩余PCR產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 膠體金與金標(biāo)墊的制備

50 mL蒸餾水倒人錐形瓶中,滴加850 μL 5 mg/mL氯金酸,加熱到微沸,再滴加900 μL 1%檸檬酸三鈉同時(shí)攪拌,當(dāng)溶液顏色由紫紅色變成紅色時(shí),繼續(xù)攪拌加熱5 min即可,冷卻,于4 ℃冰箱中保存。

取1 mL制備好的膠體金溶液,用K2CO3,調(diào)至pH值約為8,再加入4 μL抗體振蕩反應(yīng)1 h后,再加入1/10體積的10% BSA,繼續(xù)振蕩反應(yīng)0.5 h,以9 600g離心7 min,產(chǎn)生紅色沉淀;10% BSA 100 μL復(fù)溶后均勻滴加到玻璃纖維上30 ℃干燥,備用。

1.2.4 膠體金雙重試紙條的組裝

試紙條由樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜和吸水墊4個(gè)部分組成。首先將羊抗鼠二抗、FITC抗體和SAV用10 mmol/L PB(pH值為7.4)稀釋至1 mg/mL用噴膜儀依次噴至NC膜上,作為質(zhì)控線和2條檢測線,37 ℃烘10 min后取出,最后將樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜和吸水墊依次粘貼在塑料底板上,用切條機(jī)切割成4 mm寬的試紙條保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 試紙條的檢測1.2.5.1 不同封閉劑的優(yōu)化

在膠體金與標(biāo)記抗體偶聯(lián)過程中,加入不同的封閉劑(10% BSA,10% HSA,0.5% OVA,0.5% Casein和0.5% Na-Casein),確定最適宜的封閉條件。

1.2.5.2 靈敏度檢測

取不同濁度空腸彎曲菌(107、106、105、104、103、102、101、0 CFU/mL)的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物用10 mmol/L PB稀釋10倍上樣,10 min后肉眼觀察其顯線情況。

1.2.6 特異性檢測

利用大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、志賀氏菌和副溶血性弧菌ATCC33847的基因組DNA為模板擴(kuò)增,再將得到的產(chǎn)物用于做特異性實(shí)驗(yàn),同時(shí)以空腸彎曲菌作為陽性對照。

1.2.7 實(shí)際樣品檢測

采用本實(shí)驗(yàn)建立并優(yōu)化的空腸彎曲桿菌毒力基因多重膠體金的檢測方法,對牛奶樣品進(jìn)行檢測,并對其結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測原理

空腸彎曲菌毒力基因多重檢測的原理如圖1所示。

對用于PCR擴(kuò)增的上下游引物分別修飾上識別基團(tuán)或分子,即mapA上下游引物分別修飾有Digoxin和Biotin,而cdtB上下游引物分別修飾有Digoxin和FITC。當(dāng)2種目標(biāo)DNA都存在時(shí),經(jīng)過PCR后可分別得到兩端帶有Digoxin和Biotin及Digoxin和FITC的雙鏈DNA分子,再用于試紙條檢測時(shí),即可觀察到C線和2條T線;若只有1種目標(biāo)DNA存在時(shí),只能觀察到C線和其中的1條T線;若2種目標(biāo)DNA都不存在時(shí),在試紙條上就只能觀察到C線。

2.2 空腸彎曲菌mapA和cdtB預(yù)擴(kuò)增

取107、106、105、104、103、102、101、0 CFU/mL的空腸彎曲菌保守序列mapA和毒力基因cdtB的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL進(jìn)行瓊脂糖電泳驗(yàn)證其擴(kuò)增效果。已知mapA的目的片段為589 bp,cdtB的目的片段為620 bp。本研究所得的空彎mapA和cdtB基因的瓊脂糖電泳結(jié)果如圖2所示,圖2中顯示的結(jié)果正好與此相印證,并且沒有其余的雜帶和引物二聚體,說明擴(kuò)增效果很好,且靈敏度能達(dá)到102、101CFU/mL。圖2中，M表示Marker;1～8依次表示空腸彎曲菌濁度為107、106、105、104、103、102、101、0 CFU/mL

圖2 mapA和cdtB在空腸彎曲菌中的電泳結(jié)果

2.3 封閉劑種類的選擇

免疫層析試紙條制備過程中封閉劑的選擇對于其檢測的靈敏度高低極為重要。用制備的試紙條對已知空白樣品進(jìn)行檢測,優(yōu)化結(jié)果如圖3所示,比較10% BSA、10% HSA、0.5% OVA、0.5% Casein和0.5% Na-Casein 5種封閉劑,mapA和cdtB的檢測結(jié)果顯示只有BSA和OVA沒有假陽,再根據(jù)質(zhì)控線的顯線強(qiáng)度比較可知BSA封閉顯線強(qiáng)度較高,因此確定偶聯(lián)封閉劑為10% BSA。

圖3 mapA和cdtB在不同封閉劑下的試紙條優(yōu)化結(jié)果

2.4 空腸彎曲菌的敏感性檢測結(jié)果

2.4.1mapA和cdtB的單重檢測結(jié)果

制作好的免疫膠體金試紙條于肉眼下觀察,10 min即可出現(xiàn)結(jié)果。分別對空腸彎曲菌中的保守序列mapA和毒力基因cdtB利用雙重試紙條進(jìn)行敏感性檢測,其結(jié)果如圖4所示。

圖4 mapA和cdtB的單重檢測結(jié)果

從圖4可以看出,在只有mapA或者cdtB獨(dú)立存在的情況下,隨著空腸彎曲菌從101CFU/mL增大到107CFU/mL,檢測線的顯線強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng),且mapA基因在105CFU/mL之后保持穩(wěn)定不變,而cdtB基因也在106CFU/mL之后到達(dá)平衡。結(jié)果表明,mapA和cdtB互相之間不存在交叉現(xiàn)象。

2.4.2mapA和cdtB的多重檢測結(jié)果

同時(shí)對空腸彎曲菌中的mapA和cdtB進(jìn)行敏感性檢測,即將兩者的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋后混合上樣,10 min后觀察結(jié)果如圖5a所示,圖5a中1～8依次表示空腸彎曲菌濁度為107、100、105、104、103、102、101、0 CFU/mL,由圖5a可知，隨著空腸彎曲菌濁度的增大,2條T線顏色均逐漸增強(qiáng),且靈敏度皆可達(dá)到101CFU/mL,同時(shí)都在106CFU/mL處達(dá)到穩(wěn)定。

再根據(jù)顯色結(jié)果對C、T線作出峰型圖以及根據(jù)峰型圖得出的線性圖,結(jié)果如圖5b和圖5c所示,T1線和T2線的峰高均隨著細(xì)菌濁度的增大而逐漸增大。結(jié)果表明,在101～107CFU/mL范圍內(nèi),所建立的免疫膠體金檢測方法對mapA和cdtB的同時(shí)檢測具有良好的線性關(guān)系。

圖5 mapA和cdtB的雙重檢測結(jié)果

2.5 特異性驗(yàn)證

提取大腸桿菌、沙門氏菌等7株實(shí)驗(yàn)菌株的基因組DNA,以它們?yōu)槟０?用擴(kuò)增的空腸彎曲桿菌引物進(jìn)行PCR,再用已建立的方法對得到的產(chǎn)物進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖6a所示。

圖6 mapA和cdtB的特異性檢測結(jié)果

圖6a中，1～9依次為mapA與cdtB混合物、mapA、cdtB、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃葡萄球菌、單增李斯特菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌。從圖6可以看出，1～3號的T線出現(xiàn)顯線,其余均只有C線顯線,即只有在空腸彎曲菌存在的情況下才顯線,同時(shí)對顯線結(jié)果做出了峰型，結(jié)果如圖6b所示,從圖6b也可以看出此方法的特異性很強(qiáng)。

2.6 牛奶樣品的檢測結(jié)果

將1 mL的空腸彎曲菌原液添加于9 mL牛奶樣品中,再取出1 mL用于基因組DNA的提取,并進(jìn)行PCR擴(kuò)增,同時(shí)雙蒸水作為陰性對照,再將產(chǎn)物用于試紙條檢測,結(jié)果如圖7所示,其中圖7b、7c分別為峰型圖和線性結(jié)果。

用PCR預(yù)擴(kuò)增再經(jīng)由膠體金試紙條檢測所得的靈敏度依然可以達(dá)到101CFU/mL，從而說明了此方法的可靠性和有效性。

(c)圖7 實(shí)際樣品的檢測結(jié)果

3 結(jié) 論

空腸彎曲桿菌作為目前受到國內(nèi)外廣泛重視的一種人畜共患病原菌[24-25],本文建立于PCR基礎(chǔ)上的膠體金免疫層析試紙條檢測方法包括對目的基因預(yù)擴(kuò)增和對擴(kuò)增產(chǎn)物的試紙條檢測2個(gè)部分,能快速(肉眼在10 min內(nèi))、準(zhǔn)確、靈敏地判定結(jié)果,操作簡單,即使不是專業(yè)的人員也可以現(xiàn)場使用[26-28]。此外該方法利用了PCR的高效性和試紙條檢測的快速簡便性,具有較高的敏感性和特異性,在牛奶樣品中可以檢測到101CFU/mL,相對于瓊脂糖電泳圖的結(jié)果提高了10倍。同時(shí)也保證了檢測的時(shí)效性和準(zhǔn)確性,適用于實(shí)時(shí)檢測。

本研究成功建立了空腸彎曲桿菌免疫層析檢測方法,研制的試紙條對空腸彎曲桿菌具有很高的特異性和敏感性。實(shí)時(shí)驗(yàn)證結(jié)果表明,試紙條使用方便、快捷、且操作簡單,適合對空腸彎曲桿菌感染進(jìn)行現(xiàn)場早期檢測及鑒別診斷。本方法的建立為空腸彎曲桿菌的現(xiàn)場早期檢測奠定了基礎(chǔ)。