延髓頭端腹內(nèi)側(cè)部NADPH氧化酶2激活導(dǎo)致活性氧簇釋放在皮膚/肌肉切開(kāi)和牽拉引起的慢性術(shù)后疼痛中的作用*

代娟麗，楊 濤，魏緒紅

（1華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東深圳518052；2中山大學(xué)生理教研室，疼痛研究中心，廣東廣州510080；3中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，廣東廣州510120）

慢性術(shù)后疼痛（chronic postoperative pain，CPSP）是在臨床中長(zhǎng)期面臨但一直沒(méi)有引起人們重視和解決的問(wèn)題之一。據(jù)報(bào)道，普通手術(shù)如甲狀腺手術(shù)或開(kāi)胸手術(shù)后，約10%～50%的患者會(huì)產(chǎn)生CPSP，即在手術(shù)過(guò)后2個(gè)月，在排除了慢性感染、慢性腫瘤復(fù)發(fā)等情況下，手術(shù)切口部位的持續(xù)性疼痛。CPSP持續(xù)時(shí)間可達(dá)數(shù)年，對(duì)身體健康及日?；顒?dòng)等具有顯著有害的影響［1-2］，因此預(yù)防或治療CPSP非常有必要。雖然經(jīng)過(guò)了廣泛的研究，但CPSP的機(jī)制仍不清楚。據(jù)報(bào)道，由隱神經(jīng)支配的大腿皮膚/肌肉切開(kāi)和牽拉（skin/muscle incision and retraction，SMIR）在遠(yuǎn)離手術(shù)部位的后爪上產(chǎn)生了異常機(jī)械性疼痛［3］；更重要的是，相應(yīng)部位的隱神經(jīng)并沒(méi)有發(fā)生脫髓鞘，也沒(méi)有神經(jīng)纖維數(shù)目的減少［3-4］，提示CPSP的發(fā)展涉及到更多相關(guān)原因。延髓頭端腹內(nèi)側(cè)部（rostral ventromedial medulla，RVM）由中縫大核（nucleus raphe magnus，NRM）、網(wǎng)狀巨細(xì)胞核（nucleus reticularis gigantocellularis，NGC）和網(wǎng)狀巨細(xì)胞核α部（nucleus reticularis gigantocellularis pars alpha）組成，接受來(lái)自中腦導(dǎo)水管的信息輸入，并下行傳遞至脊髓背角的痛覺(jué)傳遞神經(jīng)元［5］。RVM是下行易化系統(tǒng)的一個(gè)重要核團(tuán)。研究表明，在病理性疼痛狀態(tài)下，RVM中的5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）神經(jīng)元可被激活，然后釋放5-HT到脊髓，從而參與中樞敏化的發(fā)展和維持［6-7］。阻斷RVM的下行易化作用減輕了病理性疼痛。

活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），如O2-和H2O2，可以與一氧化氮等形成過(guò)氧化亞硝酸鹽，因而對(duì)蛋白和DNA具有過(guò)氧化作用。研究表明，ROS在神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生中起著關(guān)鍵作用［8-9］。ROS水平在神經(jīng)病理性疼痛時(shí)升高［10］；系統(tǒng)給予ROS清除劑可以減輕脊神經(jīng)結(jié)扎引起的痛過(guò)敏［11］并抑制NMDA受體亞基NR1的磷酸化［12］。NADPH氧化酶（NADPH oxidase，NOX）的催化亞基gp91phox（NOX2）和調(diào)節(jié)亞基p22phox在細(xì)胞膜上形成異二聚體，同時(shí)受到一些胞漿分子（p47phox、p67phox、p40phox及Rac蛋白）的調(diào)節(jié)。NOX是體內(nèi)ROS的主要來(lái)源，也是體內(nèi)唯一直接產(chǎn)生ROS的酶［13］。研究表明，在外周神經(jīng)損傷或強(qiáng)直刺激后，脊髓背角NOX2在慢性疼痛的產(chǎn)生中起著關(guān)鍵作用［14-15］，但RVM內(nèi)NOX2-ROS在CPSP中的作用尚不清楚。因此，本研究擬觀察SMIR導(dǎo)致的病理性疼痛大鼠RVM內(nèi)NOX2及ROS生成的情況，并進(jìn)一步觀察抑制NOX2激活或清除ROS對(duì)SMIR誘導(dǎo)的痛覺(jué)過(guò)敏及對(duì)RVM和脊髓背角5-HT含量的影響，以此明確RVM內(nèi)NOX2來(lái)源的ROS是否通過(guò)促進(jìn)5-HT向脊髓的釋放來(lái)參與CPSP的發(fā)生發(fā)展。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量220～250 g，由中山大學(xué)北校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（國(guó)家級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）提供。于室溫（22.0±0.5）℃、濕度55%±10%、12 h光照-黑暗循環(huán)、安靜環(huán)境下單籠飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食。隨機(jī)進(jìn)行如下分組：（1）假手術(shù)組及SMIR（1 d和7 d）組，進(jìn)行行為學(xué)機(jī)械痛敏檢測(cè)及NOX2和8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8-hydroxyguanine，8-OHdG）免疫熒光染色半定量分析；假手術(shù)組、SMIR組、SMIR+術(shù)前RVM內(nèi)注射N(xiāo)OX2阻斷肽（gp91dstat）組、SMIR+術(shù)前RVM內(nèi)注射無(wú)序肽（scrambled dstat）組、SMIR+術(shù)后RVM內(nèi)注射gp91ds-tat組、SMIR+術(shù)后RVM內(nèi)注射scrambled ds-tat組、SMIR+RVM注射ROS清除劑N-叔丁基-α-苯基硝酮（N-tert-butyl-αphenylnitrone，PBN）組和SMIR+RVM內(nèi)注射生理鹽水組，進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試及5-HT測(cè)定。每組各5只。

2 方法

2.1 SMIR模型手術(shù)根據(jù)以前的研究進(jìn)行SMIR手 術(shù)［3-4］。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將動(dòng)物用異氟烷（1.5%～2.5%）、30%N2O和70%O2的混合物麻醉后，在左側(cè)后大腿內(nèi)側(cè)靠近隱靜脈大約4mm處的皮膚表面做一個(gè)1.5～2.0 cm的切口，暴露出大腿肌肉。然后在大腿肌肉淺層做一個(gè)7～10 mm切口，插入微型解剖牽開(kāi)器（Biomedical Research Instruments）。將大腿的皮膚和淺表肌肉牽拉2 cm并持續(xù)1 h。假手術(shù)組只進(jìn)行皮膚切開(kāi)但不牽拉。

2.2 50%機(jī)械刺激撤足閾值的測(cè)定按照魏緒紅等［16］和汪小芳等［17］的方法進(jìn)行手術(shù)同側(cè)后肢（左側(cè)）50%機(jī)械刺激撤足閾值的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)前1周將動(dòng)物放入若干有機(jī)玻璃箱內(nèi)以熟悉測(cè)試環(huán)境，每天1次，每次20 min。該有機(jī)玻璃箱下方有一金屬網(wǎng)，網(wǎng)格大小為0.8 cm×0.8 cm，用以將von Frey hair伸入其內(nèi)測(cè)定動(dòng)物撤足閾值。正式實(shí)驗(yàn)前先將動(dòng)物放入玻璃箱內(nèi)等待安靜，待動(dòng)物充分安靜（洗臉、搔抓、直立、行走等活動(dòng)完全停止）又不處于睡眠狀態(tài)時(shí)，開(kāi)始進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)采用Up-Down［4］的方法，選用8根強(qiáng)度呈對(duì)數(shù)遞增的von Frey hair（0.41、0.70、1.20、2.04、3.63、5.50、8.51和15.14 g）垂直向上施加于動(dòng)物后肢足心部進(jìn)行機(jī)械性刺激，待纖毛彎曲，停留6～8 s，若動(dòng)物出現(xiàn)撤足，則選擇相鄰遞減的刺激強(qiáng)度給予刺激，若動(dòng)物未撤足，則選擇相鄰遞增的刺激強(qiáng)度給予刺激。每次刺激之間至少間隔5 min。按照所述方法依次使用不同強(qiáng)度的纖毛進(jìn)行測(cè)試，待動(dòng)物出現(xiàn)撤足反應(yīng)后再連續(xù)進(jìn)行5次刺激（一開(kāi)始的撤足反應(yīng)也算為1次）便終止測(cè)試。以第1個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)的前一點(diǎn)為起始點(diǎn)，連續(xù)6次的刺激結(jié)果為最終的撤足反應(yīng)模式，被認(rèn)為是該動(dòng)物的撤足反應(yīng)模式。根據(jù)測(cè)試結(jié)果，通過(guò)計(jì)算公式可求出50%機(jī)械刺激撤足閾值。50%機(jī)械刺激撤足閾值（g）=10Xf+kδ/10 000。公式中Xf為最末次測(cè)試von Frey hair的對(duì)數(shù)值；K值可根據(jù)撤足反應(yīng)模式查表得出［5］；δ值為8根von Frey hair間對(duì)數(shù)差值的均值。

2.3 立體定位注射藥物為了將藥物顯微注射入RVM，我們使用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，并將其置于大鼠腦立體定位儀上。在頭皮正中沿矢狀縫做一個(gè)2 cm的切口，用30%雙氧水將下面的結(jié)締組織腐蝕溶解，清晰暴露顱骨。再次確保顱骨表面水平。接下來(lái)，用定位儀在目標(biāo)核團(tuán)的顱骨表面投影處進(jìn)行標(biāo)記，再任選該點(diǎn)周?chē)我?點(diǎn)處進(jìn)行標(biāo)記，用鉆孔儀對(duì)這標(biāo)記的4點(diǎn)分別進(jìn)行開(kāi)鉆，將骨質(zhì)鉆開(kāi)，目的核團(tuán)投影點(diǎn)的鉆孔深度以露出顱骨下方的硬腦膜為準(zhǔn)，而其余3點(diǎn)不宜鉆穿，用螺絲刀將3個(gè)螺絲釘固定于該3點(diǎn)內(nèi)防止后續(xù)風(fēng)干的牙托水與顱骨表面分離，只留下目的核團(tuán)投影點(diǎn)用于導(dǎo)管的插入。此時(shí)，用定位儀小心將導(dǎo)管垂直插入顱骨下方目標(biāo)核團(tuán)內(nèi)，注意應(yīng)提前確保坐標(biāo)無(wú)誤（RVM坐標(biāo)為：前囟向后-10.5 mm，中線(xiàn)旁開(kāi)0 mm，腦表面腹側(cè)-8.5 mm）。插入后維持導(dǎo)管不動(dòng)，將牙托水和牙托粉以適當(dāng)比例混合后均勻澆入導(dǎo)管和螺絲四周，待其風(fēng)干后緩慢旋開(kāi)導(dǎo)管帽以確保導(dǎo)管帽未與導(dǎo)管粘連，便于后續(xù)旋開(kāi)給藥。術(shù)后3 d內(nèi)每天1次為大鼠肌注青霉素以防顱內(nèi)感染。手術(shù)后允許動(dòng)物恢復(fù)7 d。用連接至30號(hào)規(guī)格注射器的漢密爾頓注射器進(jìn)行藥物注射操作。在2 min內(nèi)將1μL藥物注入RVM。將注射針（比導(dǎo)管突出1 mm）保持在位60 s以使藥物從尖端完全擴(kuò)散。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，行冰凍切片（50μm）在顯微鏡下進(jìn)行注射位點(diǎn)的觀察。

2.4 動(dòng)物灌注及標(biāo)本處理使用烏拉坦（1.5 g/kg，ip）麻醉大鼠后固定于水槽上方的板上，剪開(kāi)胸腔，經(jīng)主動(dòng)脈快速灌注常溫（25℃）的肝素化生理鹽水300 mL，隨后灌注4%的4℃多聚甲醛300 mL，前5 min快速灌注，后30 min慢速滴注。灌注完畢后解剖動(dòng)物，取出整個(gè)大腦組織（包括大腦、小腦和腦干）后，放入4%的多聚甲醛中后固定3 h，隨后轉(zhuǎn)入30%蔗糖中脫水3 d。經(jīng)蔗糖脫水后的標(biāo)本取出進(jìn)行冰凍橫向切片（LEICA CM1900），厚度為40μm，收集于裝有0.01 mol/L PBS的24孔板內(nèi)，4℃短暫保存。

2.5 免疫熒光組織化學(xué)染色收集腦冰凍切片，6孔板裝0.01 mol/L PBS洗片5 min×3次，室溫（25℃）下封閉液封閉1 h。封閉后棄去封閉液，加入含有待檢測(cè)蛋白抗體的Ⅰ抗稀釋液（NOX2，1∶100，Affinity Biosciences；8-OHdG，1∶200，Abcam），置于4℃搖床過(guò)夜（＞12 h）。吸去Ⅰ抗，使用0.01 mol/L PBS洗片10 min×3次，隨后加入針對(duì)Ⅰ抗來(lái)源的熒光Ⅱ抗，室溫（25℃）下避光搖床上慢搖1 h。棄去Ⅱ抗，0.01 mol/L PBS洗片10 min×3次。使用的Ⅰ抗為抗神經(jīng)元特異性核蛋白（neuron-specific nuclear protein，NeuN；神經(jīng)元標(biāo)志物）抗體（1∶300；Chemicon，MAB377）、抗膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP；星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物）抗體（1∶500；Chemicon，MAB360）、抗離子鈣結(jié)合銜接分子1（ionized calcium-binding adapter molecule 1，Iba1；小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物）抗體（1∶500；Abcam，aa221790）和抗OX-42（小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物）抗體（1∶200；Chemicon，CBL1512）。隨機(jī)挑選處理好的切片貼于載玻片上，使用抗熒光淬滅劑封片后立即于熒光顯微鏡（LEICA DFC350 FX Camera）下觀察并拍照保存。采用ImageJ計(jì)算熒光光密度。

2.6 ELISA迅速提取脊髓背角L3處和腦組織RVM部分，在1 mL 1×PBS中均勻化并在-20℃下儲(chǔ)存過(guò)夜。在進(jìn)行2次凍融循環(huán)以破壞細(xì)胞膜后，將勻漿物在5 000×g，4℃離心5 min。首先用BCA法檢測(cè)樣品上清液蛋白濃度。再使用競(jìng)爭(zhēng)性抑制ELISA方案，用購(gòu)買(mǎi)的5-HTELISA試劑盒進(jìn)行樣品中5-HT濃度測(cè)定（Cat#CSB-E08364r，CUSABIO）。具體為將酶標(biāo)板設(shè)1個(gè)空白對(duì)照孔、不加任何液體；每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)依次各設(shè)2孔，每孔加入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品50μL；其余每個(gè)檢測(cè)孔直接加待測(cè)標(biāo)本50μL。檢測(cè)操作嚴(yán)格按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（A值），使用Curve Expert軟件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)以確定樣品中5-HT的濃度，用測(cè)得上述5-HT濃度除以樣品的蛋白濃度進(jìn)行歸一化處理。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。所有行為學(xué)測(cè)試結(jié)果均采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析。同一組大鼠不同測(cè)試時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)先用Friedman方差分析（Friedman ANOVA）檢驗(yàn)差異，然后再用配對(duì)的秩和檢驗(yàn)（Wilcoxon matched pairs test）進(jìn)行分析。兩個(gè)不同實(shí)驗(yàn)組某個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。免疫熒光光密度和ELISA測(cè)得的5-HT濃度先用單因素方差分析（one-way ANOVA）處理數(shù)據(jù)，然后用Tukey法進(jìn)行多重比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SMIR引起長(zhǎng)時(shí)間的機(jī)械痛敏

行為學(xué)測(cè)試發(fā)現(xiàn)，分別與手術(shù)前基礎(chǔ)值或假手術(shù)組比較，SMIR后大鼠同側(cè)后肢50%機(jī)械刺激撤足閾值于手術(shù)后1 d顯著下降（P＜0.01），7 d降至最低點(diǎn)（P＜0.01），顯著性差異一直保持至術(shù)后3周左右，術(shù)后32 d已恢復(fù)至基礎(chǔ)水平，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The effect of skin/muscle incision and retraction（SMIR）on the 50%paw withdrawal threshold［von Frey（VF）hair test］.Compared with-1 d（1 d before surgery），the 50%paw withdrawal threshold was significantly decreased for 22 d in SMIR rats but not in sham rats.Mean±SEM.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs-1 d.圖1 皮膚/肌肉切開(kāi)和牽拉1 h對(duì)大鼠50%機(jī)械刺激撤足閾值的影響

2 SMIR引起RVM內(nèi)NOX2表達(dá)上調(diào)

免疫組化染色結(jié)果顯示，SMIR可引起RVM內(nèi)NOX2的表達(dá)上調(diào)。如圖2所示，與假手術(shù)組相比，SMIR術(shù)后1 d時(shí)NOX2的表達(dá)已顯著上調(diào)，7 d時(shí)進(jìn)一步上調(diào)。免疫熒光雙染結(jié)果顯示，上調(diào)的NOX2（7 d時(shí)）主要位于NeuN標(biāo)記的神經(jīng)元（圖3A～C），但也部分存在于Iba1標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞（圖3D～F）及GFAP標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞（圖3G～I(xiàn)）內(nèi)。

3 預(yù)先RVM內(nèi)給予NOX2阻斷肽可防止SMIR引起機(jī)械痛敏，術(shù)后給藥則無(wú)效

為了研究NOX2表達(dá)上調(diào)與疼痛的產(chǎn)生及維持之間的關(guān)系，我們?cè)赗VM內(nèi)微量注射（注射位點(diǎn)見(jiàn)圖4C）NOX2阻斷肽gp91ds-tat（50μmol/L，共1μL，SMIR術(shù)前30 min開(kāi)始，每天1次，共3次），結(jié)果發(fā)現(xiàn)gp91ds-tat可阻斷SMIR引起的機(jī)械痛敏，而給予相同劑量的scrambled ds-tat則無(wú)作用（圖4A）。在另外5只大鼠，SMIR后7 d開(kāi)始于RVM內(nèi)微量注射gp91ds-tat（每天1次，共3次），但對(duì)已經(jīng)降低的機(jī)械痛閾無(wú)顯著影響（圖4B）。ELISA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，SMIR后7 d RVM和脊髓背角內(nèi)5-HT的含量顯著增加，術(shù)前給予gp91ds-tat顯著降低了RVM和脊髓背角內(nèi)5-HT的含量，而術(shù)后給予gp91ds-tat對(duì)RVM和脊髓背角內(nèi)5-HT的釋放均無(wú)顯著影響，見(jiàn)圖5。無(wú)論是術(shù)前還是術(shù)后給予scrambled ds-tat對(duì)SMIR引起的5-HT釋放增加均無(wú)顯著影響，見(jiàn)圖5。這些結(jié)果提示SMIR后RVM內(nèi)NOX2的激活可能通過(guò)引起脊髓內(nèi)5-HT釋放增多進(jìn)而引起慢性疼痛。

4 RVM內(nèi)給予gp91ds-tat可抑制SMIR引起RVM內(nèi)8-OHd G生成增多

圖2 皮膚/肌肉切開(kāi)牽拉對(duì)RVM內(nèi)NOX2表達(dá)的影響

8-OHdG是ROS攻擊DNA分子中的鳥(niǎo)嘌呤堿基第8位碳原子而產(chǎn)生的一種氧化性加合物。我們進(jìn)一步觀察了SMIR后不同時(shí)點(diǎn)8-OHdG的水平以反映RVM內(nèi)ROS的生成情況。結(jié)果顯示，與sham組（圖6A）相比，8-OHdG在SMIR術(shù)后1 d即顯著增加（圖6B、D），7 d時(shí)進(jìn)一步增加（圖6C、D）。免疫熒光雙染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SMIR 7 d時(shí)，8-OHdG在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞上大量存在（圖6E、F），但小膠質(zhì)細(xì)胞與8-OHdG共染的比例較少（圖6G）。與scrambled ds-tat組相比，RVM內(nèi)預(yù)先給予gp91ds-tat（SMIR術(shù)前30 min開(kāi)始，每天1次，共3次）可顯著降低SMIR后7 d時(shí)RVM內(nèi)8-OHdG的水平（圖6I～K）。

5 SMIR術(shù)后RVM內(nèi)注射ROS清除劑可短暫抑制機(jī)械痛敏

SMIR術(shù)后7 d RVM內(nèi)注射一次ROS清除劑PBN可以短暫翻轉(zhuǎn)已經(jīng)產(chǎn)生的機(jī)械痛敏。如圖7所示，與術(shù)前相比，SMIR大鼠的50%機(jī)械刺激撤足閾值在術(shù)后7 d時(shí)已顯著下降，提示產(chǎn)生了機(jī)械痛敏；此時(shí)給予PBN（100 mmol/L，1μL）可使大鼠的50%機(jī)械刺激撤足閾值在給藥后8 h及12 h顯著升高，提示RVM內(nèi)ROS的持續(xù)產(chǎn)生是維持SMIR后慢性疼痛的關(guān)鍵因素。

討 論

有研究顯示CPSP主要由手術(shù)期間外周神經(jīng)的損傷產(chǎn)生［2］。然而，近期研究表明，SMIR模型在沒(méi)有神經(jīng)損傷的情況產(chǎn)生了CPSP［3］。我們之前的研究也表明，SMIR模型并沒(méi)有導(dǎo)致隱神經(jīng)的退行性變，也沒(méi)有引起L3背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的損傷，相反的，SMIR引起的脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞及星型膠質(zhì)細(xì)胞的激活，并參與CPSP的產(chǎn)生［4］，提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)的改變也參與CPSP的產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)SMIR可引起RVM內(nèi)神經(jīng)元及小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)NOX2表達(dá)上調(diào)，阻斷NOX2的表達(dá)可防止SMIR引起的機(jī)械痛敏并可減少RVM及脊髓背角內(nèi)下行性易化遞質(zhì)5-HT的含量，SMIR后已經(jīng)引起機(jī)械痛敏的情況下再阻斷NOX2的作用則無(wú)效。其次，該研究進(jìn)一步證實(shí)SMIR可導(dǎo)致RVM內(nèi)ROS釋放增多，術(shù)后7 d于RVM內(nèi)注射ROS清除劑PBN可減輕已經(jīng)產(chǎn)生的機(jī)械痛敏。

RVM的下行易化已被認(rèn)為在維持神經(jīng)病理性疼痛［18-19］中起重要作用。研究顯示，RVM的5-HT能神經(jīng)元特異性地投射到脊髓背角的淺層［20］。眾所周知，脊髓背角淺層神經(jīng)元接受外周傷害性刺激信息，并將信號(hào)整合后進(jìn)一步上傳給丘腦，因此RVM內(nèi)5-HT具有下行性調(diào)制痛覺(jué)信號(hào)上傳的作用是有解剖學(xué)基礎(chǔ)的。5-HT最初被認(rèn)為具有抑制疼痛的作用，是痛覺(jué)下行抑制系統(tǒng)釋放的重要遞質(zhì)之一［21］，然而后來(lái)逐漸發(fā)現(xiàn)在外周神經(jīng)損傷后其具有易化疼痛的作用［22］。相同部位釋放的同一遞質(zhì)為何能產(chǎn)生不同的作用呢？這可能是因?yàn)椴±硇蕴弁礌顟B(tài)時(shí)脊髓背角痛覺(jué)傳遞神經(jīng)元5-HT受體亞型的表達(dá)發(fā)生了變化，從而導(dǎo)致神經(jīng)元的高興奮性。在正常情況下，5-HT1A受體在中縫核和脊髓等區(qū)域高表達(dá)，RVM釋放的5-HT主要發(fā)揮了突觸前抑制的作用，即通過(guò)與脊髓背角內(nèi)痛覺(jué)初級(jí)傳入纖維末梢上的5-HT1A受體結(jié)合，抑制了初級(jí)傳入纖維末梢向脊髓釋放谷氨酸，從而抑制了痛覺(jué)信號(hào)從脊髓向丘腦的傳遞。而在病理性情況下，由于脊髓非選擇性配體門(mén)控通道5-HT3受體表達(dá)上調(diào)［23］，5-HT與5-HT3受體結(jié)合，對(duì)鈉、鉀和鈣離子通透性增加，并最終導(dǎo)致神經(jīng)元的高興奮性并誘導(dǎo)痛覺(jué)過(guò)敏［23-24］。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)SMIR導(dǎo)致脊髓背角5-HT含量增多。本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞裂解后測(cè)定細(xì)胞勻漿中的5-HT，測(cè)定的5-HT既包含了細(xì)胞內(nèi)合成的，也包含了釋放到細(xì)胞外的。研究發(fā)現(xiàn)，脊髓所有的5-HT能傳入都來(lái)自于脊髓以上結(jié)構(gòu)。雖然中縫核的一小部分5-HT能神經(jīng)元（其主要支配丘腦、背側(cè)海馬、紋狀體和皮層）會(huì)發(fā)出側(cè)枝到脊髓。但脊髓主要的5-HT傳入來(lái)源于RVM［25］。因此我們認(rèn)為脊髓的5-HT主要是RVM內(nèi)5-HT能神經(jīng)元的軸突末梢所釋放。由此推測(cè)由RVM起源的5-HT介導(dǎo)的下行性易化作用在SMIR后可能增強(qiáng)了，并進(jìn)一步作用于5-HT3受體參與了異常性機(jī)械疼痛的發(fā)生發(fā)展。

Figure 3.The cell types expressing NOX2 at 7 d after SMIR.Mean±SEM.n=3.圖3 SMIR后RVM內(nèi)表達(dá)NOX2的細(xì)胞類(lèi)型

研究表明RVM內(nèi)給予Tph-2-shRNA以特異性地耗竭內(nèi)源性5-HT可以防止動(dòng)物在神經(jīng)損傷后出現(xiàn)慢性疼痛［6］，而鞘內(nèi)注射選擇性5-HT3受體激動(dòng)劑SR57227可以誘導(dǎo)痛超敏反應(yīng)［26］，這些結(jié)果與我們的結(jié)果相互印證。也有研究表明，盡管脊神經(jīng)結(jié)扎后5-HT能神經(jīng)元的數(shù)量減少，但剩余的5-HT能神經(jīng)元可能介導(dǎo)下行易化作用［27］。因此，可以推斷來(lái)自RVM的5-HT可能通過(guò)作用于脊髓的5-HT3受體加劇疼痛超敏反應(yīng)。

Figure 4.The effect of NOX2 blocking peptide gp91ds-tat on mechanical allodynia.A：microinjection of gp91ds-tat（50μmol/L in 1 μL，started 30 min before SMIR，once daily for 3 times）prevented the development of mechanical allodynia following SMIR，whereas the same dose of scrambled ds-tat had no effect；B：microinjection of gp91ds-tat（50μmol/L in 1μL，started at day 7 after SMIR，once daily for totally 3 days）had no obvious effect on the already decreased 50%paw withdrawal threshold；C：the location of the guide cannula（the black line indicated the tip of the guide cannula；the red circle indicated the RVM，where drug diffused into，as the injection needle was 1 mm longer than the guide cannula）.Mean±SEM.n=5.**P＜0.01 vs-1 d；#P＜0.05，##P＜0.01 vs scrambled ds-tat+SMIRgroup.圖4 RVM內(nèi)注射N(xiāo)OX2阻斷肽gp91ds-tat對(duì)SMIR引起的機(jī)械痛敏的影響

盡管RVM釋放的5-HT在慢性疼痛中的作用已得到很好的闡明，但5-HT釋放增加的機(jī)制仍不清楚。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SMIR后NOX2在RVM中上調(diào)，RVM內(nèi)預(yù)防性給予NOX2阻斷肽可緩解機(jī)械痛敏并降低RVM和脊髓背角中的5-HT水平；其次，SMIR可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)核酸氧化產(chǎn)物8-OHdG表達(dá)明顯增多，而給予NOX2阻斷肽可降低RVM內(nèi)8-OHdG水平。ROS生成增多可對(duì)蛋白和DNA產(chǎn)生過(guò)氧化作用，并可誘導(dǎo)TNFα/BDNF等炎癥介質(zhì)釋放。RVM的神經(jīng)元可以分成兩種類(lèi)型，一類(lèi)具有較寬的動(dòng)作電位，較負(fù)的靜息膜電位且對(duì)μ受體激動(dòng)劑不敏感，另外一類(lèi)具有較窄的動(dòng)作電位，可能伴有自發(fā)的放電，細(xì)胞膜上表達(dá)MOR且對(duì)μ阿片受體激動(dòng)劑產(chǎn)生超級(jí)化反應(yīng)［28］。在正常情況下，阿片類(lèi)物質(zhì)部分地通過(guò)減少RVM神經(jīng)元的GABA信息傳遞，激活下行抑制系統(tǒng)而產(chǎn)生抑制疼痛的作用，然而在炎癥狀態(tài)下，無(wú)論是GABA的輸入活動(dòng)還是GABAA受體的性質(zhì)都會(huì)發(fā)生改變，引起GABA能抑制性突觸傳遞功能減弱（去抑制），由此可能導(dǎo)致MOR陽(yáng)性神經(jīng)元被特異性的激活（即興奮性增高），并向脊髓釋放5-HT，因而導(dǎo)致下行性易化作用［29］。而炎癥可通過(guò)抑制RVM內(nèi)GAD67的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致神經(jīng)元的興奮性過(guò)高［30］。因此我們推測(cè)在CPSP產(chǎn)生過(guò)程中，NOX2激活所釋放的ROS可能通過(guò)引起RVM內(nèi)MOR陽(yáng)性神經(jīng)元的GABA抑制性突觸傳遞功能減弱，進(jìn)而導(dǎo)致MOR陽(yáng)性神經(jīng)元興奮性增高，最終易化脊髓的疼痛信息傳遞，導(dǎo)致CPSP的產(chǎn)生。我們的研究顯示，NOX2及ROS的核酸氧化產(chǎn)物8-OHdG不僅存在于RVM的神經(jīng)元內(nèi)，也存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，外周神經(jīng)損傷［31-32］后激活的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元的功能。一旦被激活，膠質(zhì)細(xì)胞可以釋放一系列促炎介質(zhì)，包括細(xì)胞因子、NO、COX-2等，這將改變神經(jīng)元的生存環(huán)境。因此，雖然下行易化作用是由神經(jīng)元釋放的神經(jīng)遞質(zhì)所介導(dǎo)的，但SMIR后RVM中膠質(zhì)細(xì)胞的激活可以改變神經(jīng)元的生存環(huán)境，進(jìn)而導(dǎo)致其釋放5-HT增多。預(yù)防性阻斷NOX2的激活可能通過(guò)抑制RVM的ROS生成而顯著減輕CPSP的產(chǎn)生，術(shù)后阻斷NOX2的激活對(duì)已經(jīng)產(chǎn)生的機(jī)械痛敏已經(jīng)沒(méi)有作用，這時(shí)候雖然抑制NOX2不再產(chǎn)生更多的ROS，但已經(jīng)產(chǎn)生的ROS不能被清除，并且這些已經(jīng)產(chǎn)生的ROS可以與NOX1、NOX4等產(chǎn)生正反饋，從而繼續(xù)產(chǎn)生更多的ROS。因此抑制NOX2雖然可能減少ROS的產(chǎn)生，但并不能消除ROS已經(jīng)產(chǎn)生的作用。而ROS清除劑則可以更徹底地清除ROS并阻斷其作用，因而具有一定的止痛作用，但其效果非常短暫，說(shuō)明之前ROS的累積作用很難被消除。

Figure 5.Preemptive but not postoperative application of gp91ds-tat decreased the level of 5-HT in RVM and spinal dorsal horn（SDH）following SMIR.Mean±SEM.n=5.**P＜0.01 vs shamgroup；##P＜0.01 vs scrambled ds-tat+SMIRgroup.圖5 術(shù)前或術(shù)后給予gp91ds-tat對(duì)RVM和脊髓背角內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT含量的影響

Figure 6.The expression of 8-hydroxyguanine（8-OHdG）in RVM after SMIRand the effect of gp91ds-tat microinjection into RVM on 8-OHdG expression.Compared with sham group（A），8-OHdG was increased at 1 d（B）and 7 d（C）after SMIR.The quantification of 8-OHdG positive area in the 3 groups was shown（D）.The 8-OHdG was located in NeuN-labeled neurons（E）and GFAP-labeled astrocytes（F），and to a less extent in OX-42-labeled microglia（G）at 7 d after SMIR.The percentages of 8-OHdG positive cells in neurons，microglia and astrocytes were shown（H）.Compared with scrambled-tat+SMIR group（I），preemptive treatment with gp91ds-tat（J）significantly decreased the expression of 8-OHdGin RVM at 7 d after SMIR.The quantification of 8-OHdGpositive area in gp91ds-tat-and scrambled ds-tat-treated SMIRrats was shown（K）.Mean±SEM.n=3-5.##P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs scrambled ds-tat+SMIR group.圖6 SMIR后8-OHd G在RVM的表達(dá)情況及RVM內(nèi)給予gp91ds-tat對(duì)8-OHdG表達(dá)的影響

Figure 7.Microinjection of phenyl-N-tert-butylnitrone（PBN）into RVM transiently depressed the already established mechanical allodynia［von Frey（VF）hair test］.Mean±SEM.n=6.**P＜0.01 vs saline+SMIR group.圖7 SMIR后7 d RVM內(nèi)注射ROS清除劑PBN可短暫減輕已經(jīng)產(chǎn)生的機(jī)械痛敏

綜上所述，以RVM內(nèi)NOX2-ROS途徑為靶點(diǎn)的干預(yù)措施可能會(huì)成為預(yù)防CPSP的重要方法。