李小杰，劉暢，李成軍，楊立均，邱睿，宋瑞芳，陳玉國，白靜科，李淑君*

1 煙草行業(yè)黃淮煙區(qū)煙草病蟲害綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，許昌 461000；

2 河南省煙草公司駐馬店市公司，駐馬店 463000；

3 中國煙草總公司河南省公司，鄭州 450018

青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）寄主范圍廣，可侵染50多科200多種植物[1]。煙草青枯病是危害世界煙草生產(chǎn)的重要根莖部細(xì)菌性病害，主要發(fā)生在我國長江流域及以南煙區(qū)，造成巨大損失[2,3]。近年來由于全球氣候變暖，該病害已在河南、安徽、山東、陜西等地有不同程度的發(fā)生[4-7]。

煙草青枯病屬于系統(tǒng)侵染的維管束病害，一旦發(fā)病很難得到有效控制。因此，如何在早期快速有效地檢測青枯病菌對于防止青枯病蔓延和有效控制顯得尤為重要。目前對于煙草青枯病的檢測大多采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法和血清學(xué)鑒定法。其中，傳統(tǒng)的鑒定方法需要分離得到純化的單菌落菌株，檢測過程耗時較長，很容易錯過病害的最佳防治時間，對指導(dǎo)生產(chǎn)的意義不大。而血清學(xué)方法主要是利用特異的血清抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，且隨著檢測技術(shù)的發(fā)展已研制出高靈敏度的青枯病菌檢測試紙條，對早期青枯病的快速檢測起到了重要作用[8]，但該方法制備抗體過程耗時耗力，成本較高，且極有可能存在交叉反應(yīng)，導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性[9]?，F(xiàn)代分子生物學(xué)方法可以不依賴于病原菌的純培養(yǎng)和特異抗體的制備而對樣品中的病原進(jìn)行直接檢測，可在短時間內(nèi)檢測到極微量的病原，大大提高了病原的檢測效率。

目前利用RT-qPCR、LNA-qPCR、巢氏PCR等分子技術(shù)對青枯病菌進(jìn)行檢測的報(bào)道已有很多[10-14]，其檢測關(guān)鍵是設(shè)計(jì)特異性引物。如楊嬌弟等[15]根據(jù)已公布的5個青枯菌全基因組比對結(jié)果，篩選并驗(yàn)證得到3對引物能對土壤中煙草青枯菌進(jìn)行特異性檢測。郭淼淼等[16]分別以R. solanacearum染色體上的16S rDNA ITS以及毒性質(zhì)粒攜帶的致病性相關(guān)基因fliC為靶點(diǎn)，篩選獲得特異性擴(kuò)增青枯菌的引物對RaITS-1/2和RalfliC-F/R，均能夠穩(wěn)定、快速、靈敏地檢測青枯菌DNA。

青枯雷爾氏菌存在明顯的生理分化，根據(jù)寄主范圍差異，可分為5個生理小種[17,18]。根據(jù)生理小種劃分標(biāo)準(zhǔn)，煙草青枯病菌屬于寄主范圍廣泛的生理小種1號[17,19]。本研究利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)，針對豫南煙區(qū)煙草青枯病菌1號生理小種III型生物型，篩選特異性片段并進(jìn)行特異引物的設(shè)計(jì)，同時對其特異性和靈敏度進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，以期為河南省煙草青枯病的早期診斷和快速檢測提供方法。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和煙草品種

煙草青枯病菌（R. solanacearum）、多粘芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、節(jié)桿菌（Arthrobacter）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。煙草野火病菌由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院蔣士君教授惠贈。煙草品種中煙100和云煙87種子由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所育種研究室提供。

1.2 基因組DNA的提取

細(xì)菌、植物和土壤基因組總DNA的提取分別按照天根生物公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）、植物基因組DNA提取試劑盒（DP305）和土壤基因組DNA提取試劑盒（DP336）說明書方法操作。

1.3 特異性引物設(shè)計(jì)、篩選與擴(kuò)增

利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)，以煙草青枯病菌、煙草野火病菌、多粘芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、節(jié)桿菌、熒光假單胞菌和煙草栽培品種云煙87、中煙100的基因組DNA為模板，利用隨機(jī)引物篩選煙草青枯病菌的特異片段，將獲得的特異片段送生工生物（上海）進(jìn)行測序分析，再根據(jù)特異片段序列設(shè)計(jì)特異引物，引物合成由生工生物（上海）完成。RAPD反應(yīng)體系（25 μL）：模 板DNA約50 ng，200 μmol/L dNTP，1.5 nmol/L MgCl2，0.1 μmol/L引物，200 μmol /L Ex-Taq DNA polymerase和1×PCR buffer；PCR擴(kuò)增條件為：95℃ 5 min，94℃ 45 s，37℃ 90 s，72℃ 2 min，41

個循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.4 特異引物檢測的靈敏度測定

青枯菌菌液最低檢出濃度的測定 將青枯菌置于28℃搖床上過夜培養(yǎng)，以1 mL OD600≈1.0的細(xì)菌懸浮液中青枯菌數(shù)量為109個細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)，梯度稀釋細(xì)菌懸浮液，形成109cfu/mL，108cfu/mL，107cfu/mL，…，10 cfu/mL梯度細(xì)菌懸浮液。同時以青枯菌基因組DNA為模板（模板濃度為42 ng/μL），并將模板進(jìn)行101、102、103、104、105倍稀釋，形成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀釋液。分別吸取1 μL菌液或DNA為模板，利用篩選出的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行電泳檢測。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：模板1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×PCR Taq MasterMix 12.5 μL，雙蒸水補(bǔ)足到25 μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃ 3 min；94℃ 45 s，退火溫度 45 s，72℃ 90 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。

土壤中青枯菌最低檢出量的測定 將青枯菌置于28℃搖床上過夜，以O(shè)D600=0.5的細(xì)菌懸浮液中青枯菌數(shù)量為3×108cfu/mL的標(biāo)準(zhǔn)，梯度稀釋到3×107

cfu/mL、3×106cfu/mL、3×105cfu/mL、3×104cfu/

mL。分別吸取1 mL菌液加入5 g已滅菌的土壤中，過夜培養(yǎng)。稱取0.2 g土壤提取總DNA，稀釋一定倍數(shù)后作為模板，利用篩選出的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。剩余4.8 g含菌土壤中加入45 mL水于搖床上震蕩10 min，混勻后即為10-1土壤懸浮液，按梯度稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5倍土壤懸浮液，分別吸取1 μL上清做模板進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件同上。

1.5 盆栽接種后土壤和煙株體內(nèi)青枯病菌的檢測

將土壤高溫滅菌后風(fēng)干得到無菌土，選擇健康的長至4-6片葉的煙株移栽于裝有250 g無菌土的盆缽中（直徑為上口徑95 mm×高 75 mm）。采用傷根灌根法，每株煙苗灌青枯菌菌懸液（3×108cfu/mL）10 mL，設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)接種5株煙苗，以清水為對照處理。于接種后7 d進(jìn)行病害調(diào)查和取樣，青枯病分級參照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《煙草病蟲害分級及調(diào)查方法》（GB/T23222-2008）進(jìn)行調(diào)查。分別取煙株根際土壤和煙株莖基部組織（根部向上1～2 cm處）各0.1 g，加入0.9 mL無菌水進(jìn)行研磨，制成懸浮液作為模板，利用特異引物擴(kuò)增檢測接種土壤和煙株體內(nèi)青枯病菌的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草青枯菌特異片段的獲得

利用RAPD隨機(jī)引物對8個供試基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明擴(kuò)增條帶表現(xiàn)出明顯的多態(tài)性，從1000多個隨機(jī)引物中篩選出能夠擴(kuò)增出煙草青枯病菌特異片段的引物6個（表1、圖1）。測序結(jié)果表明，這6個特異片段分別代表青枯菌基因組中不同的基因序列，其片段大小和靶基因名稱見表1。

表1 煙草青枯病菌特異片段的篩選Tab. 1 Screening of specific fragment of R. solanacearum

圖1 RAPD隨機(jī)引物的PCR擴(kuò)增Fig. 1 PCR amplification of RAPD random primers

2.2 煙草青枯菌特異引物的設(shè)計(jì)與篩選

利用Primer 5.0軟件，根據(jù)特異片段序列設(shè)計(jì)特異引物，共篩選出特異性擴(kuò)增煙草青枯病菌的引物6對（表2）。電泳檢測結(jié)果表明，篩選出的特異引物只在煙草青枯病菌基因組DNA中擴(kuò)增出條帶，且條帶明亮單一，無雜帶（圖2）。

表2 煙草青枯病菌特異引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小Tab. 2 Specific primer sequence and amplification product size of R. solanacearum

圖2 煙草青枯菌特異引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 Results of PCR amplification by specific primers for R. solanacearum

2.3 煙草青枯病菌菌液最低檢出濃度

利用篩選出的特異引物對，分別以煙草青枯病菌不同稀釋度的菌液和基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，對于基因組DNA，引物對A1T-F/R、

A6T-F/R、A7T-F/R、S6T-F/R、S13T-F/R、S18T-F/R檢測的靈敏度均可達(dá)到105的稀釋度，即0.42 pg/μL。對于青枯病菌菌液，引物對A1T-F/R、A6T-F/R、A7T-F/R、S13T-F/R能檢測到的最低濃度為105cfu/mL，引物對S6T-F/R、S18T-F/R能檢測到的最低濃度為106cfu/mL（圖3）。

圖3 特異引物的靈敏度檢測結(jié)果Fig. 3 Results of sensitivity test for specific primers

2.4 土壤中煙草青枯菌的最低檢出量

分別從每克土含菌量為1.2×107cfu、1.2×106cfu、1.2×105cfu、1.2×104cfu、1.2×103cfu的土壤中提取總DNA，并以稀釋50倍的DNA為模板進(jìn)行特異引物的PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，利用特異引物對S13T-F/R擴(kuò)增檢測的青枯菌最低含量為每克土含菌量為6×102cfu。對于土壤懸浮液，特異引物對S13T-F/R檢測的最低濃度為102稀釋度，即約3×106cfu/mL（圖4）。其他5對特異引物的擴(kuò)增結(jié)果與S13T引物一致。

圖4 特異性引物對S13T-F/R對土壤中青枯菌的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 4 Results of PCR amplification for R. solanacearum in soil by S13-TY pairs

2.5 煙草發(fā)病植株和土壤的快速檢測

接種青枯病菌后7 d，分別取不同發(fā)病程度的煙株和根際土壤，利用特異引物對A1T-F/R和S13T-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖5）。結(jié)果表明，接種的煙株根際土壤中均能擴(kuò)增出青枯病菌的特異條帶。對于煙株而言，只在病級為5的煙株中檢測到青枯病菌，而健康煙株和病級為1的煙株中未檢測出青枯病菌。由此說明，篩選出的特異引物不需提取土壤和中等發(fā)病煙株的總DNA，樣品加水研磨的懸浮液即可直接用于快速檢測。

圖5 土壤和煙株體內(nèi)青枯病菌的PCR檢測Fig. 5 PCR detection of R. solanacearum in tobacco planting soil and tobacco plant

3 結(jié)論與討論

目前RAPD（Random amplified polymorphisms DNA）分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于品種鑒定、育種、基因定位、遺傳多樣性、種質(zhì)差異等研究領(lǐng)域[20-23]，同時也可用于植物病原菌的分子診斷[24-27]，但利用該技術(shù)對煙草青枯病菌進(jìn)行特異引物篩選還鮮有報(bào)道[27]。雖然青枯病菌的分子檢測方法多樣，但使用方法不同，對青枯病菌的檢測靈敏度也有所差別。如黃雯等[28]根據(jù)青枯菌的lpx C基因序列設(shè)計(jì)得到4條LAMP特異性引物，對青枯菌的檢測靈敏度為1.42 pg/μL基因組DNA；程承等[15]利用RT-qPCR檢測方法，對試驗(yàn)土壤煙草青枯菌的最低檢測濃度為5×102cfu/g土壤；李本金等[17]利用煙草青枯病菌的特異引物RsF/RsR與細(xì)菌通用引物L(fēng)1/L2進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，其檢測靈敏度在DNA水平上可達(dá)0.4 fg/μL。本研究利用RAPD技術(shù)獲得煙草青枯病菌的特異片段6個，通過引物設(shè)計(jì)，最終得到6對煙草青枯菌特異引物，其擴(kuò)增條帶明亮單一，特異性強(qiáng)。經(jīng)對6種細(xì)菌（煙草青枯病菌、多粘芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、節(jié)桿菌、熒光假單胞菌、野火病菌）和2個煙草品種（中煙100和云煙87）的檢測驗(yàn)證，所有引物的靈敏度在DNA水平上均可達(dá)到0.42 pg/μL，對煙草青枯菌懸液最低檢出率為105～106cfu/mL，這與楊姣弟等[18]的研究結(jié)果基本一致。同時篩選出的6對引物能夠特異且高效地檢測土壤中的青枯菌含量，最低檢出量為6×102cfu/g土壤總DNA，但對土壤懸浮液的檢測靈敏度略低，這可能是由于土壤懸浮液作為模板，其復(fù)雜的成分影響了PCR反應(yīng)導(dǎo)致擴(kuò)增效率低造成的。

本研究篩選出的特異引物對A1T-F/R和S13T-F/R可直接用于接種土壤和中等發(fā)病煙株中青枯病菌的分子檢測，無需提取樣品DNA，效率更高，為河南省煙草青枯病的早期診斷提供了重要依據(jù)。但是輕微發(fā)病的煙株中未檢測到青枯病菌，這可能是由于直接以煙株的組織研磨液模板，導(dǎo)致菌含量較低所造成的，因此青枯菌含量檢測的靈敏性與煙株發(fā)病程度之間的關(guān)系還需進(jìn)一步研究，以便為煙草青枯病的監(jiān)測預(yù)警提供理論依據(jù)。另外，本研究設(shè)計(jì)的青枯病菌特異引物，只針對寄主為河南省主栽煙草品種中煙100和云煙87、生理小種為1號、生物型為III型的煙草青枯病菌，是否適用于其他寄主或生理小種的青枯病菌的檢測，還需進(jìn)一步測試。