張鴿，李志豪，鄧帥軍，李東亮，張良，蔡斌，向小華，王娟，王帆，陳國強(qiáng)，張海波*，劉好寶*,,4

1 中國科學(xué)院大學(xué)研究生院，中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，生物基材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266101；

2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，農(nóng)業(yè)部煙草生物學(xué)與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266101；

3 中國煙草總公司海南省公司?？谘┣蜒芯克？?571100；

4 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東青島 266109；

5 四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，成都 610000

雪茄煙是一種特殊的煙草制品，傳統(tǒng)概念上是指全部用煙葉卷成的煙卷，其香氣醇厚，吃味透甜、濃度大[1]。經(jīng)典的雪茄煙通常由茄衣（外包皮）、茄套（內(nèi)包皮）和茄芯（芯葉煙）組成[2]。雪茄煙生產(chǎn)中，發(fā)酵是保證雪茄煙葉品質(zhì)形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是改善雪茄煙葉外觀質(zhì)量、物理特性、內(nèi)在化學(xué)成分、吸食品質(zhì)的重要工序，被稱為雪茄煙葉生產(chǎn)的技術(shù)核心[2-6]。

雪茄煙葉常見的堆垛發(fā)酵一般要經(jīng)歷初分級、回潮、堆垛、翻垛、重新碼堆等幾個(gè)重要過程[2]。微生物在雪茄煙葉發(fā)酵中發(fā)揮重要作用。19世紀(jì)80年代，小什列晉格提出微生物作用假說[7]，近年關(guān)于微生物在煙葉發(fā)酵中作用的研究逐漸深入，包括煙葉發(fā)酵中微生物群落的表征[8-10]、微生物在煙葉發(fā)酵提質(zhì)增香中的作用[11-12]等。研究顯示，細(xì)菌在煙葉發(fā)酵品質(zhì)改善中發(fā)揮重要作用[4]，但雪茄煙葉發(fā)酵過程中細(xì)菌群落多樣性、動態(tài)演替規(guī)律以及細(xì)菌群落在發(fā)酵中的作用尚不明確，有待進(jìn)一步深入研究。本研究以海南省H382品種雪茄煙葉為實(shí)驗(yàn)材料，通過16S rRNA測序技術(shù)，在實(shí)驗(yàn)室條件下模擬人工發(fā)酵，對發(fā)酵過程中雪茄煙葉的細(xì)菌群落多樣性和群落演替進(jìn)行表征，并預(yù)測分析發(fā)酵過程中細(xì)菌的功能，期望為揭示雪茄煙葉微生物發(fā)酵機(jī)理提供理論參考，為篩選雪茄煙葉發(fā)酵功能細(xì)菌提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2015—2016年度海南省樂東縣抱由鎮(zhèn)種植的雪茄煙葉中部煙葉，供試品種為H382。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雪茄煙葉發(fā)酵及取樣

（1）煙葉回潮

將雪茄中部煙葉按照30～35片/把的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行扎把，扎把后按相鄰煙把間隔10～15 cm懸掛于回潮房內(nèi)，在相對濕度75%～85%、溫度25℃～27℃、回潮時(shí)間為8～10 h的條件下，進(jìn)行霧化回潮處理[13]，回潮期間翻動煙把，保證煙葉回潮均勻，最終使煙葉含水量控制在25%～35%范圍，作為待發(fā)酵實(shí)驗(yàn)樣品。

（2）煙葉發(fā)酵及取樣記錄

將回潮好的煙葉置于自封袋中，裝煙規(guī)格為6.0 kg，排掉自封袋中空氣，將自封袋置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱中溫度和濕度參數(shù)設(shè)定詳見表1。按表1中溫度濕度控制進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每完成1個(gè)升溫過程（28℃±1℃～50℃±1℃），為1個(gè)發(fā)酵周期，共進(jìn)行6個(gè)發(fā)酵周期。每個(gè)發(fā)酵周期結(jié)束后取樣200 g，包括初始樣（YB_1），第1次發(fā)酵周期完成后取樣（YB_2），第2次發(fā)酵周期完成后取樣（YB_3），第3次發(fā)酵周期完成后取樣（YB_4）、第4次發(fā)酵周期完成后取樣（YB_5）、第5次發(fā)酵周期完成后取樣（YB_6）及第6次發(fā)酵周期完成后取樣（YB_7）。取樣保證均勻，取樣樣品在液氮下研磨粉碎，混合均勻，取1.0 g±0.1 g作為細(xì)菌群落檢測樣本，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司(http://www.majorbio.com/）檢測。

表1 恒溫恒濕培養(yǎng)箱中溫度濕度變化程序設(shè)置表Tab. 1 The program of temperature and humidity in incubator

1.2.2 HTS 測序

微生物菌體收集、基因組提取、PCR擴(kuò)增、文庫構(gòu)建及上機(jī)測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成，引物選用799F（5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′），1193R（5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′），測序區(qū)域?yàn)閂5-V7區(qū)域[9,14]。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

（1）OTUs聚類：以97%的相似水平對OTU進(jìn)行聚類，保留注釋到細(xì)菌屬的OTUs，基于最小樣本序列數(shù)（34102）對OTU抽平。

（2）α多樣性分析：利用Mothur 1.30.2（https://www.mothur.org/wiki/Download_mothur）計(jì)算Alpha多樣性相關(guān)指數(shù)Shannon, simpson, Sobs, Chao1, ace,coverage。

（3）Beta多 樣 性 分 析：基 于Bray_Curtis、weighted和unweighted Unifrac距離計(jì)算距離矩陣，使用PCoA進(jìn)行結(jié)果可視化展示。

（4）PICRUSt功能預(yù)測：利用PICRUSt（http://picrust.github.io/picrust/）對細(xì)菌功能進(jìn)行預(yù)測分析。

2 結(jié)果分析

2.1 H382 雪茄煙葉發(fā)酵樣本測序OTU數(shù)目統(tǒng)計(jì)

根據(jù)表2 可知，在H382雪茄煙葉發(fā)酵過程中，OTU數(shù)目較多，細(xì)菌多樣性豐富；其中以YB_3的OTU數(shù)目最多，為222；且在發(fā)酵過程中，由YB_2到Y(jié)B_3，OTU數(shù)目呈增加趨勢，YB_4，YB_5直至YB_6樣本中呈現(xiàn)減少趨勢，最后YB_7中OTU數(shù)目又有少量增加。細(xì)菌的多樣性在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)先增加后降低，最后略有增加，基本趨于平穩(wěn)的趨勢。

表2 發(fā)酵樣本OTU數(shù)目統(tǒng)計(jì)Tab. 2 The numbers of OTU in samples

2.2 H382雪茄煙葉發(fā)酵樣本測序結(jié)果的Alpha多樣性分析

根據(jù)coverage和以Sobs指數(shù)為代表的稀釋曲線（圖1）趨勢可知，測序結(jié)果能夠覆蓋雪茄煙葉發(fā)酵中表面細(xì)菌群落多樣性。表3結(jié)果顯示，所測樣本中，YB_1和YB_3中的Sobs指數(shù)最大，與Chao1和ace指數(shù)趨勢一致，說明YB_1和YB_3 2個(gè)樣本中的物種總數(shù)最多；shannon數(shù)值中，YB_1、YB_2、YB_3和YB_4 4個(gè)樣本中，數(shù)值相對較高，說明群落多樣性高，與simpson指數(shù)反映的結(jié)果一致。

圖1 H382雪茄煙葉發(fā)酵測序稀釋曲線Fig. 1 The rarefaction curve in fermentation samples of H382 cigar leaves

表3 細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)表Tab. 3 The α diversity index of bacterial community

2.3 海南H382雪茄煙葉發(fā)酵過程細(xì)菌群落分析

根據(jù)表4統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，YB_1初始樣本中共包含27個(gè)屬，在發(fā)酵啟動的YB_2樣本中，細(xì)菌的種類及含量發(fā)生較大變化，Enterococcus、Bacillus、Oceanobacillus、Cronobacter以 及Paracoccus含 量分別由1.1%、0.63%、0.48%、0.23%和0.0088%上升至19%、9.4%、6.5%、2.9%和4.6%，提升比例分別為17.3、14.9、13.5、12.6和522.7倍，可能在H382雪茄煙葉發(fā)酵啟動中發(fā)揮重要作用。相反，

unclassified-f-Enterobacterriaceae、Methylobacterium

以及Enterobacter含量分別由11%、5.4%和2.1%降低至0.58%，0.23%，0.0059%，可能在發(fā)酵啟動中發(fā)揮作用較小。另外，Aerococcus和Georgenia在YB_2中含量接近為0，且Aerococcus在發(fā)酵過程中含量極少，在YB_4、YB_6和YB_7樣本中含量痕量，接近為0（出現(xiàn)結(jié)果為0的原因有二方面，一方面因測序中OTU是采用97%的相似度聚類，可能存在合并；另一方面測序結(jié)果按樣本最小序列數(shù)做了抽平處理，導(dǎo)致有數(shù)字“0”出現(xiàn)），推測其在發(fā)酵中發(fā)揮作用較小；其余細(xì)菌種類含量變化差異相對較小，其 中，Terribacillus、Cronobacter、Lysinibacillus含量有小幅度提升，可能在發(fā)酵啟動中也發(fā)揮部分作用。其余細(xì)菌種類都有小幅度降低，可能在發(fā)酵啟動中發(fā)揮作用較小。關(guān)于這些微生物在煙葉發(fā)酵中具體作用，需要后續(xù)進(jìn)一步開展單個(gè)菌株的發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)。

在整個(gè)雪茄煙葉發(fā)酵過程中，自始至終有17個(gè)細(xì)菌屬全程貫穿整個(gè)發(fā)酵，其中Staphylococcus、Enterococcus、Paenibacillus、Lysinibacillus 4個(gè) 屬 基本呈現(xiàn)先降低后略微增加的趨勢，可能在發(fā)酵后期發(fā) 揮 較 大 作 用；Pseudomonas、Methylobacterium、

Sphingomonas、Stenotrophomonas、Bacillus、Rhizobium、Oceanobacillus、Terribacillus、Aureimonas、Microbacterium和Paracoccus 11個(gè)屬基本呈現(xiàn)先增多后降低的趨勢，尤其Pseudomonas、Sphingomonas、Bacillus、Rhizobium、Oceanobacillus、Terribacillus和Paracoccus7個(gè)屬，所占比例相對較大，可能發(fā)酵前期發(fā)揮的功能更明顯。Enterococcus、Paenibacillus、Lysinibacillus3個(gè)屬基本變化波動較大。另外，Staphylococcus在所有樣本中均大量存在，YB_1中含量較高，YB_2、YB_3和YB_4樣本中含量逐步降低，隨后樣本中含量大幅度增加并趨于穩(wěn)定。Staphylococcus可能在發(fā)酵前期發(fā)揮作用較小，在穩(wěn)定期及初始樣本中含量相對穩(wěn)定。

表4 屬水平上不同樣本中細(xì)菌種類、所占比例及具體OTU數(shù)目統(tǒng)計(jì)Tab. 4 The bacterial species, proportion and the number of OTUs in different samples at genus level %

在本實(shí)驗(yàn)條件下，發(fā)酵過程中主要的細(xì)菌群落演替規(guī)律如圖2所示：由發(fā)酵初期的Staphylococcus、Enterococcus和Pantoea，演變?yōu)榘l(fā)酵中期Oceanobacillus、Paracoccus、Staphylococcus和Bacillus，隨后演變?yōu)镻seudomonas和Enterobacter，最后穩(wěn)定為Staphylococcus和Terribacillus。

圖2 屬水平上發(fā)酵樣本中細(xì)菌群落組成及演替柱狀圖Fig. 2 The bacterial community composition and succession histogram in fermentation samples in genus level

另外，對雪茄煙葉發(fā)酵樣本中的OTU聚類進(jìn)行分組總結(jié)，結(jié)果（表5）所示，在雪茄煙葉發(fā)酵過程中，細(xì)菌種類所占比例大部分在0.1%～1%和1%～10%之間，雖然這部分細(xì)菌種類占比較小，但細(xì)菌種類豐富，可能在煙葉發(fā)酵中發(fā)揮較為重要作用。

表5 雪茄煙葉發(fā)酵樣本中每個(gè)占比分組統(tǒng)計(jì)中OTU數(shù)目Tab. 5 The number of OTUs in each group during fermentation of cigar leaves

2.4 樣品Beta多樣性分析

PCoA分析（Principal co-ordinates analysis），即主坐標(biāo)分析，可用來研究樣本群落組成的相似性，在PCoA結(jié)果中顯示為群落結(jié)構(gòu)相似度高的樣本傾向于聚集在一起。

圖3中的7個(gè)點(diǎn)分別代表海南H382雪茄煙葉發(fā)酵中的7個(gè)樣本，兩樣本越接近，表明兩樣本物種組成相似度越高?；趗nweighted UniFrac distances的PCoA結(jié)果分析表明，7組樣本基本可分為3組，其中的YB_1和YB_2樣本相似度較高，為Ⅰ組；YB_3和YB_4樣本相似度較高，為Ⅱ組；YB_5、YB_6和YB_7 3組樣本的相似度較高，為Ⅲ組。

圖3 H382雪茄煙葉發(fā)酵樣本的PCoA結(jié)果Fig. 3 The PCoA result in fermentation samples of H382 cigar leaves

2.5 H382雪茄煙葉發(fā)酵樣本測序結(jié)果PICRUSt功能預(yù)測及分組比較

16 S的直系同源簇COG（cluster of orthologous group）功能預(yù)測是通過PICRUSt[15]對OTU豐度表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，獲得OTU對應(yīng)的COG家族信息，并計(jì)算各COG的豐度。根據(jù)比對到COG庫的COG編號，可以從eggNOG數(shù)據(jù)庫中解析到各個(gè)COG的描述信息及其功能信息，從而得到功能豐度譜。

根據(jù)圖4結(jié)果分析可知：不同發(fā)酵樣本中涉及的COG功能種類基本一致，但功能的相對豐度有較大差異（表6）。

圖4 發(fā)酵樣本的COG功能預(yù)測Fig. 4 The COG function prediction in fermentation samples

表6 所測發(fā)酵煙葉單一樣本中細(xì)菌功能預(yù)測統(tǒng)計(jì)表Tab. 6 Function prediction of bacterial in each fermentation sample

續(xù)表6

由圖5結(jié)果可知，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、3組的預(yù)測功能種類上差異較小，但功能豐度差異較大，其中以Ⅱ組豐度最高，Ⅰ組次之，Ⅲ組最低。根據(jù)預(yù)測結(jié)果可知，Ⅰ組（YB_1，YB_2）前五位可預(yù)測功能為：氨基酸運(yùn)輸和代謝、碳水化合物運(yùn)輸和代謝、通用功能預(yù)測、轉(zhuǎn)錄以及無機(jī)離子運(yùn)輸和代謝；Ⅱ組（YB_3，YB_4）前五位可預(yù)測功能為：氨基酸運(yùn)輸和代謝、通用功能預(yù)測、轉(zhuǎn)錄、碳水化合物運(yùn)輸和代謝以及無機(jī)離子運(yùn)輸和代謝；Ⅲ組（YB_5，YB_6，YB_7）前五位可預(yù)測功能為：通用功能預(yù)測、氨基酸運(yùn)輸和代謝、轉(zhuǎn)錄、無機(jī)離子運(yùn)輸和代謝和翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物轉(zhuǎn)化。尤其在發(fā)酵關(guān)鍵階段中，氨基酸運(yùn)輸和代謝和碳水化合物運(yùn)輸和代謝功能豐度更高。

圖5 分組樣本功能預(yù)測比較分析結(jié)果Fig. 5 The comparative analysis results of function prediction in three groups

3 討論

3.1 H382雪茄煙葉發(fā)酵中細(xì)菌多樣性表征及群落演替分析

16 S rRNA高通量測序技術(shù)在表征細(xì)菌群落多樣性中應(yīng)用廣泛[14,16-20]。通過對海南H382雪茄煙葉發(fā)酵過程中細(xì)菌群落多樣性及演替規(guī)律進(jìn)行表征，初步認(rèn)識到在不同發(fā)酵時(shí)期發(fā)揮作用的主體微生物不同。根據(jù)測序結(jié)果，海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、土地芽胞桿菌屬（Terribacillus）、副球菌屬（Paracoccus）、芽胞桿菌屬（Bacillus）、腸球菌屬（Enterococcus）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）等細(xì)菌在雪茄煙發(fā)酵關(guān)鍵階段中的豐度較高，其中，芽孢桿菌屬占比重較高，與前期對墨西哥雪茄煙葉中的微生物種類研究基本相同，但含量略有差異[9]。海洋芽孢桿菌屬、土地芽孢桿菌屬、副球菌屬以及腸桿菌屬等菌屬在雪茄煙葉發(fā)酵中均為首次發(fā)現(xiàn)，為研究雪茄煙葉發(fā)酵微生物多樣性及功能提供了新的依據(jù)。海洋芽孢桿菌、土地芽胞桿菌屬及芽孢桿菌屬生理特性豐富多樣，能分泌淀粉酶、蛋白酶、果膠酶、纖維素酶等[21,22]，推測其在煙葉發(fā)酵大分子物質(zhì)降解中發(fā)揮重要作用[23-26]。煙葉中果膠物質(zhì)不完全燃燒會形成甲醇，并進(jìn)一步氧化成甲醛、甲酸等[27]，增加煙葉風(fēng)險(xiǎn)，并且研究表明，煙葉中果膠含量會影響烤煙的柔韌性[28]，在雪茄外包皮煙葉（茄衣）研究中，適度降解煙葉中果膠物質(zhì)含量，可能會有助于提升雪茄外包皮煙葉（茄衣）的韌性，改善茄衣的物理特性。此外，烤煙中研究發(fā)現(xiàn)纖維素不完全燃燒會使煙葉刺激性增大，產(chǎn)生嗆咳感[29]，根據(jù)功能預(yù)測，推測芽孢桿菌屬可能在降低雪茄煙葉刺激性、改善雪茄煙葉品質(zhì)中發(fā)揮作用。假單胞菌屬在尼古丁降解[30,31]方面研究較多，有可能在調(diào)整煙葉勁頭，改善上部煙葉品質(zhì)上具有重要作用。劉燕等[32]研究發(fā)現(xiàn)副球菌具有脫氮反硝化特性，馬永見等[33]研究發(fā)現(xiàn)副球菌屬具有鄰苯二價(jià)酸酯降解特性，鞘氨醇單孢菌在生物降解方面[34,35]具有重要作用。值得關(guān)注的是，葡萄球菌屬的存在與前期墨西哥雪茄煙葉表面細(xì)菌群落結(jié)果和較早關(guān)于雪茄發(fā)酵中的結(jié)果[4,9]一致，但關(guān)于葡萄球菌屬在雪茄煙葉發(fā)酵中的作用還未進(jìn)行深入研究。

將微生物的功能研究進(jìn)行分類整理，對挖掘其在雪茄煙葉發(fā)酵中的作用具有指導(dǎo)意義，但微生物生長環(huán)境不同，代謝活動也有差異，具體在雪茄煙葉發(fā)酵中如何發(fā)揮作用，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。且雪茄煙葉的微生物發(fā)酵是混菌發(fā)酵的過程，細(xì)菌的功能研究不能僅僅局限在單一菌群的作用中，混菌的研究及使用在雪茄煙葉發(fā)酵中更為重要，以便為雪茄煙葉的人工發(fā)酵控制提供指導(dǎo)。

3.2 海南H382雪茄煙葉發(fā)酵中細(xì)菌功能預(yù)測

PICRUSt分析與數(shù)據(jù)庫比對，將微生物的變化情況和生物功能聯(lián)系，能初步揭示不同樣本下細(xì)菌功能的差異[15,36]。本實(shí)驗(yàn)使用PICRUSt功能預(yù)測，分析發(fā)酵過程中樣本間的功能差異，并根據(jù)PCoA結(jié)果，將相似度較高的樣本進(jìn)行分組功能預(yù)測。可知在發(fā)酵過程中，氨基酸運(yùn)輸和代謝以及碳水化合物運(yùn)輸和代謝兩種功能豐度最高，尤其在Ⅱ組中，一方面可能與Ⅱ組包含的兩個(gè)樣本中所含OTU種類較豐富有關(guān)，另一方面可能由于YB_3和YB_4兩個(gè)樣本中，Oceanobacillus、Paracoccus、Pseudomonas等細(xì)菌種類所占的比例急劇增加，參與了雪茄煙葉發(fā)酵中的含碳化合物和含氮化合物的降解過程，維持菌體自身生長代謝。

將優(yōu)勢微生物與功能預(yù)測結(jié)果相結(jié)合，有利于篩選雪茄煙葉發(fā)酵過程中的功能微生物，對揭示雪茄煙葉的發(fā)酵過程和發(fā)酵機(jī)理、微生物在雪茄煙葉發(fā)酵中的作用具有重要意義。但PICRUSt功能預(yù)測存在局限性，隨科技進(jìn)步，后期結(jié)合宏基因組測序[36]，對篩選功能基因和功能微生物以及揭示煙葉微生物的發(fā)酵機(jī)理具有重要意義。雪茄煙葉的人工發(fā)酵是一個(gè)多周期的過程，發(fā)酵中會涉及翻堆、重新碼堆等操作[37,38]，研究雪茄煙葉的發(fā)酵機(jī)理，應(yīng)結(jié)合發(fā)酵工藝，不僅對多個(gè)發(fā)酵周期進(jìn)行細(xì)致研究，更需要對一個(gè)發(fā)酵周期內(nèi)的關(guān)鍵點(diǎn)，如煙葉成分明顯發(fā)生降低或增加的點(diǎn)，溫度明顯增加、降低或平穩(wěn)的點(diǎn)等，包括結(jié)合微生物演替變化規(guī)律、酶活變化、煙葉成分及含量變化、環(huán)境因子變化以及雪茄煙葉評價(jià)進(jìn)行統(tǒng)一分析，不僅更有助于揭示雪茄煙葉的發(fā)酵機(jī)理，更為人工精準(zhǔn)控制雪茄煙葉發(fā)酵提供理論指導(dǎo)。

4 結(jié)論

明確了H382雪茄煙葉發(fā)酵過程中細(xì)菌群落組成多樣性豐富，優(yōu)勢菌群主要為葡萄球菌屬、海洋芽胞桿菌屬、假單胞菌屬等；在本實(shí)驗(yàn)條件下，發(fā)酵過程中首要的細(xì)菌群落演替規(guī)律為：由發(fā)酵初期的Staphylococcus、Enterococcus和Pantoea，演變?yōu)榘l(fā)酵中 期Oceanobacillus、Paracoccus、Staphylococcus和Bacillus，隨后演變?yōu)镻seudomonas和Enterobacter，最后穩(wěn)定為Staphylococcus和Terribacillus；細(xì)菌主要功能預(yù)測為氨基酸運(yùn)輸和代謝、碳水化合物的運(yùn)輸和代謝等。本文為揭示雪茄煙葉的微生物發(fā)酵機(jī)理提供了一種新的研究思路。