劉 斌,饒 智,李俊明,吳 鈺,謝夢(mèng)洲
(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長(zhǎng)沙 410208;2.湖南省藥食同源功能性食品工程技術(shù)研究中心,湖南長(zhǎng)沙 410208)
酵素是指選取一種或多種新鮮水果、蔬菜、食用菌、中草藥為基礎(chǔ)原料,經(jīng)乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等多種有益菌發(fā)酵而使原材料生物活性增強(qiáng)或產(chǎn)生新的生物活性的物質(zhì)[1]。關(guān)于酵素的研究最早在20世紀(jì)初起源于日本,后來(lái)發(fā)展到歐美和我國(guó)臺(tái)灣地區(qū),成為了相當(dāng)成熟的產(chǎn)業(yè),有上千萬(wàn)消費(fèi)者每天服用酵素產(chǎn)品[2]。近30年來(lái),中國(guó)人的血脂水平逐步升高,血脂異常患病率明顯增加。2012年全國(guó)調(diào)查結(jié)果顯示[3],中國(guó)成人血脂異??傮w患病率高達(dá)40.40%,較2002年呈大幅度上升[4]。高脂血癥是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)而形成心腦血管事件的主要因素之一,有效防治血脂異常是預(yù)防心腦血管疾病的重要途徑[5]。目前,市面上流通的治療藥物對(duì)肝臟有一定損害及副作用,故不適合長(zhǎng)期服用,患者順應(yīng)性差。因此,選取藥食同源中藥,開(kāi)發(fā)具有防治高脂血癥的保健食品具有廣闊的市場(chǎng)前景和重要的社會(huì)科學(xué)意義。
山藥甘、平,歸脾、肺、腎經(jīng),有益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)脾肺腎、固精止帶的功效。藥理試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,山藥多糖具有有效調(diào)節(jié)糖尿病小鼠糖脂代謝紊亂的作用[6],可降低糖尿病小鼠體內(nèi)血糖(GLU)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的濃度,緩解體重減輕的狀況。茯苓甘、淡、平,歸心、脾、腎經(jīng),有利水滲濕、健脾、寧心的功效。茯苓有很好的利尿作用,健康人服用茯苓水煎劑,有明顯的利水效果;對(duì)心源性水腫患者的利水效果非常好,日劑量100 g時(shí)效果最好[7]。目前,關(guān)于具有降血脂功能的藥食同源中藥酵素的研究鮮有報(bào)道。試驗(yàn)以山藥[8]、茯苓[9]等5味藥食同源中藥為主要原料[10],植物乳酸桿菌為發(fā)酵菌種,通過(guò)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化水提工藝及發(fā)酵工藝,總多糖含量和干浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo),采用紫外分光光度法、苯酚-硫酸顯色測(cè)定總多糖的百分含量,從而為山藥茯苓復(fù)合酵素飲料開(kāi)發(fā)成降血脂的功能性食品提供科學(xué)依據(jù)[11]。
山藥飲片,產(chǎn)地河南;茯苓飲片,產(chǎn)地湖南;植物乳酸桿菌CICC21790,中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供;MRS肉湯培養(yǎng)基BS1137,杭州百思生物技術(shù)有限公司提供;無(wú)水葡萄糖對(duì)照品,上海沃凱生物技術(shù)有限公司提供(批號(hào):20080415);苯酚,廣東光華科技股份有限公司提供(批號(hào):20160701);硫酸,株洲市星空化玻有限責(zé)任公司有限公司提供(批號(hào):20171120);乙醇,上海沃凱生物技術(shù)有限公司提供(批號(hào):20180413);實(shí)驗(yàn)室用水為純化水,試劑均為分析醇。
UV900B型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),北京萊伯泰科產(chǎn)品;ATX124型電子天平,東京島津儀器有限公司產(chǎn)品;HY-4型調(diào)速多用振蕩器,常州榮華儀器制造有限公司產(chǎn)品;DIKW-S-6型電熱恒溫水浴鍋,北京市永光明醫(yī)療儀器產(chǎn)品;KM5200DE型超聲波清洗器,昆山美美超聲儀器產(chǎn)品;N-301010L型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,日本東京理化產(chǎn)品;SCIENTZ-10N型冷凍干燥機(jī),寧波新芝生物科技股份產(chǎn)品;SFY-20BL型水分測(cè)定儀,深圳市冠亞水分儀科技產(chǎn)品;HNYC-203T型智能恒溫培養(yǎng)振蕩器,天津歐諾儀器股份有限公司產(chǎn)品;TGL18W型高速冷凍離心機(jī),長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司產(chǎn)品。
2.1.1 對(duì)照品溶液的制備
精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒質(zhì)量的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品20.4 mg,置100 mL容量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得0.204 mg/mL無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液。
2.1.2 供試品溶液的制備
取各正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到的水提物和發(fā)酵制得的干浸膏約0.5 g,加入80%乙醇100 mL先研磨,使之分散成混懸水溶液,再轉(zhuǎn)移至三角瓶中,加熱回流1.0 h,趁熱濾過(guò),濾渣與濾器用熱80%乙醇30 mL分次洗滌,棄去濾液,濾渣連同濾紙置燒瓶中,加水150 mL,加熱回流1.0 h,趁熱濾過(guò),同上操作,再重復(fù)提取1次[12]。用少量熱水洗滌濾器,合并濾液與洗液,放冷,轉(zhuǎn)移至500 mL量瓶中,用純化水稀釋至刻度,搖勻[13]。
2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
精密量取對(duì)照品溶液0,0.1,0.2,0.4,0.7,1.0 mL,分別置于10 mL具塞刻度試管中,再分別加水補(bǔ)至2.0 mL,各精密加入5%苯酚溶液1 mL,搖勻,迅速加入硫酸7 mL,密封;用調(diào)速多用振蕩器混勻,放置10 min,置40℃水浴中保溫15 min,取出,迅速冷卻至室溫,于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程Y=0.037 8X+0.024 7,線性相關(guān)系數(shù)R=0.999 5,結(jié)果表明葡萄糖質(zhì)量濃度在0~20.4μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2.1.4 供試品溶液的測(cè)定方法
精密移取制備的供試品溶液1 mL,置于10 mL具塞刻度試管中,加水補(bǔ)至2.0 mL;精密加入5%苯酚溶液1 mL,搖勻,迅速精密加入硫酸7 mL,密封;用調(diào)速多用振蕩器混勻,放置10 min,置于40℃水浴中保溫15 min,取出,迅速冷卻至室溫,于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程計(jì)算總多糖百分含量[14]。
2.2.1 山藥、茯苓水提取物制備的基本工藝
按處方比例稱取山藥、茯苓等5味中藥飲片,加一定量純化水超聲浸泡一定時(shí)間,在一定的水浴溫度下加熱回流一定時(shí)間[15-16],過(guò)濾;濾渣第二次加一定量純化水,在一定的水浴溫度下加熱回流一定時(shí)間,過(guò)濾;合并2次濾液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃,30 r/min,30 kPa的條件下減壓濃縮至藥材:濃縮液=1∶1左右,再冷凍干燥成干浸膏粉(含水量<5.0%)。
2.2.2 山藥、茯苓水提取工藝正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)
取山藥、茯苓共9份,每份按照正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平表(表1)進(jìn)行水提物(干浸膏)的制備,測(cè)定干浸膏得率[17]及總多糖含量。
水提取工藝因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1,水提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)總多糖百分含量及干浸膏得率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2,水提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)總多糖及干浸膏得率因素間方差分析見(jiàn)表3,水提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)總多糖百分含量及干浸膏得率各因素的水平間方差分析見(jiàn)表4。
表1 水提取工藝因素與水平設(shè)計(jì)
表2 水提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)總多糖百分含量及干浸膏得率測(cè)定結(jié)果
表3 水提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)總多糖百分含量及干浸膏得率因素間方差分析
表4 水提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)總多糖百分含量及干浸膏得率各因素的水平間方差分析
以總多糖百分含量為評(píng)價(jià)指標(biāo):A因素水平間差別皆具有統(tǒng)計(jì)意義,取A因素的1水平,即水提溫度95℃,B、C、D因素可任意取值;以干浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo):A因素水平間差別皆具有統(tǒng)計(jì)意義,取A因素的1水平,即水提溫度95℃,B因素水平間差別皆具有統(tǒng)計(jì)意義,取2水平或3水平,因2水平加水量少于3水平,故B因素取2水平,即加水量第1次為12倍,第2次為10倍。C因素水平間差別皆具有統(tǒng)計(jì)意義,取2水平或3水平,因2水平提取時(shí)間短于3水平,故C因素取2水平,即提取時(shí)間第1次為2.0 h,第2次為1.5 h。D因素可取任意值,因1水平超聲浸泡時(shí)間最短,故D因素取1水平,即超聲浸泡時(shí)間為0.5 h。
2.2.3 水提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果
對(duì)水提工藝所得到的優(yōu)化工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),取3批山藥及茯苓飲片,每批總量1.0 kg,加純化水量為藥材量的12,10倍,超聲浸泡時(shí)間為0.5 h,水提溫度95℃,水提取時(shí)間為2.0,1.5 h,測(cè)得總多糖含量為8.796%,RSD=1.957%(n=3),干浸膏得率為7.514%,RSD=1.745%,驗(yàn)證結(jié)果略高于正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)中的最高值,表明該工藝科學(xué)、合理、穩(wěn)定、可行。
2.3.1 山藥、茯苓復(fù)合酵素的發(fā)酵基本工藝
2.3.2 菌種的培養(yǎng)與分離
培養(yǎng)植物乳酸桿菌(MRS肉湯培養(yǎng)基,接種量0.1%,37℃,180 r/min振蕩培養(yǎng))至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期,然后4℃條件下以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心10 min棄上清液取菌體,無(wú)菌生理鹽水洗滌菌體2次(重懸菌體后離心棄上清液),再加純化水制成混懸液以備接種[18]。
2.3.3 山藥、茯苓復(fù)合酵素的發(fā)酵工藝優(yōu)化
(1)山藥、茯苓復(fù)合酵素的發(fā)酵工藝正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)。選取對(duì)發(fā)酵工藝影響較大的接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行考查,按干浸膏混懸水溶液體積的5%,10%,15%加入菌液進(jìn)行發(fā)酵[19],發(fā)酵液靜置澄清2 h后,取上清液以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心10 min,將上清液用0.45μm濾膜過(guò)濾,即得山藥茯苓復(fù)合酵素水溶液,再冷凍干燥得山藥茯苓復(fù)合酵素的干浸膏,計(jì)算干浸膏得率,測(cè)定總多糖百分含量[20]。
山藥、茯苓復(fù)合酵素的發(fā)酵工藝因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表5,發(fā)酵工藝正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)總多糖及干浸膏得率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6,發(fā)酵工藝正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)總多糖含量及干浸膏得率因素間方差分析見(jiàn)表7,發(fā)酵工藝正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)總多糖各因素的水平間方差分析見(jiàn)表8。
表5 山藥、茯苓復(fù)合酵素的發(fā)酵工藝因素與水平設(shè)計(jì)
表6 發(fā)酵工藝正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)總多糖含量及干浸膏得率測(cè)定結(jié)果
干浸膏得率因素間方差分析皆無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,故不必進(jìn)行水平間方差分析。
表7 發(fā)酵工藝正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)總多糖及干浸膏得率因素間方差分析
表8 發(fā)酵工藝正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)總多糖含量各因素的水平間方差分析
以總多糖百分含量為評(píng)價(jià)指標(biāo):A'、B'、C'因素水平間皆有統(tǒng)計(jì)意義,A'因素取2水平或3水平,即接種量10%或15%,考慮經(jīng)濟(jì)效益,取2水平為佳,即接種量10%;B'因素取2水平或1水平,即發(fā)酵溫度31℃或34℃,考慮經(jīng)濟(jì)效益,取1水平為佳,即發(fā)酵溫度31℃;C'因素取3水平,即發(fā)酵時(shí)間為72 h。以干浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo):A'、B'、C'、D'因素可任意取值,即同總多糖百分含量分析結(jié)果。
所謂的信息化人力資源管理主要指的是,組織中利用網(wǎng)絡(luò)化的技術(shù)手段,在意識(shí)與戰(zhàn)略性人力資源的支持下,展現(xiàn)較強(qiáng)的實(shí)踐性實(shí)施。
(2)山藥、茯苓復(fù)合酵素的發(fā)酵工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果。對(duì)山藥、茯苓復(fù)合酵素的發(fā)酵工藝所得到的優(yōu)化工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證:取3批山藥、茯苓等5味藥食同源中藥的水提干浸膏(即2.2.3項(xiàng)下的干浸膏),加30倍純化水研磨分散成混懸水溶液,加入混懸水溶液體積10%的菌液,在溫度31℃,轉(zhuǎn)速為180 r/min的條件下發(fā)酵72 h,將發(fā)酵液除菌后再冷凍干燥成干浸膏,測(cè)得總多糖百分含量為23.97%,RSD=1.843%(n=3),干浸膏得率為22.41%,RSD=1.972%,發(fā)酵工藝驗(yàn)證結(jié)果略高于正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)中的最高值,表明該工藝科學(xué)、合理、穩(wěn)定、可行。
將山藥、茯苓復(fù)合酵素水提最優(yōu)工藝與發(fā)酵最優(yōu)工藝進(jìn)行總多糖含量對(duì)比分析。
山藥、茯苓復(fù)合酵素發(fā)酵前后總多糖百分含量對(duì)比分析見(jiàn)表9。
由表9可知,山藥、茯苓等5味藥食同源中藥,經(jīng)發(fā)酵后總多糖百分含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未經(jīng)發(fā)酵的水提物中的總多糖百分含量,是發(fā)酵前水提物中總多糖百分含量的2.725倍。
表9 山藥、茯苓復(fù)合酵素發(fā)酵前后總多糖百分含量對(duì)比分析
(1)以總多糖百分含量和干浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo),優(yōu)化后的山藥茯苓復(fù)合酵素發(fā)酵工藝為發(fā)酵菌種植物乳酸桿菌,接種量10%,發(fā)酵溫度31℃,發(fā)酵時(shí)間72 h。山藥、茯苓水提液的最佳提取工藝為水提溫度95℃,加水量第1次為12倍,第2次為10倍,取時(shí)間第1次為2.0 h,第2次為1.5 h,超聲浸泡時(shí)間為0.5 h。在此工藝優(yōu)化條件下,山藥茯苓復(fù)合酵素的總多糖百分含量達(dá)23.97%是發(fā)酵前水提山藥、茯苓等5味藥食同源中藥最優(yōu)工藝總多糖百分含量(8.796%)的2.725倍。研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)植物乳酸桿菌發(fā)酵制作的山藥茯苓復(fù)合酵素中降血脂活性成分總多糖百分含量比發(fā)酵前含量顯著增加,很可能增強(qiáng)了產(chǎn)品的降血脂功能,為后期降血脂功能試驗(yàn)提供理論依據(jù),且同類研究未見(jiàn)報(bào)道。
(2)在預(yù)試驗(yàn)中,采用同一份樣品比較發(fā)酵前后總多糖百分含量測(cè)定結(jié)果就得知發(fā)酵后比發(fā)酵前總多糖含量高很多,但發(fā)酵前后的工藝皆未優(yōu)化,不能準(zhǔn)確闡述發(fā)酵前后總多糖百分含量的對(duì)比變化結(jié)果,故在正式試驗(yàn)時(shí)采用發(fā)酵前水提最優(yōu)工藝3批驗(yàn)證結(jié)果與發(fā)酵的最優(yōu)工藝3批驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行比較,即得到了最科學(xué)合理正確的總多糖百分含量對(duì)比結(jié)果。
(3)試驗(yàn)中僅采用了植物乳酸桿菌作為發(fā)酵菌種,未進(jìn)行多種菌種的比較是因?yàn)橹参锶樗釛U菌對(duì)植物性發(fā)酵原料具有較強(qiáng)的生物活性轉(zhuǎn)化能力、且安全無(wú)毒,發(fā)酵工藝成熟,便于掌握,故最初選用該菌種進(jìn)行預(yù)試,并且產(chǎn)生了預(yù)期的理想結(jié)果,故產(chǎn)品僅用植物乳酸桿菌作為發(fā)酵菌種。