李曉斌，馬 晨，李鳳鳴，黃新新，米熱古麗·伊馬木，臧長(zhǎng)江，李佳豪，李 超，馬利鑫，曹 蕊

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】微生物代謝在妊娠期扮演者重要角色，是確保母體和胎兒健康的關(guān)鍵[1]。妊娠期母體與胎兒之間微生物傳播研究開(kāi)始增多[2-4]。研究母體與胎兒之間存在微生物傳播的可能，對(duì)深入了解這類(lèi)細(xì)菌進(jìn)入羊水后對(duì)胎兒胃腸道菌群多樣性的影響具有重要的意義。【前人研究進(jìn)展】早期研究，新生動(dòng)物腸道獲取的第一批微生物來(lái)自分娩過(guò)程母體的產(chǎn)道，通過(guò)第1次哺乳后不斷增加并豐富。近期，更多的研究發(fā)現(xiàn)，新生動(dòng)物在胎兒期就已經(jīng)感染一定量的微生物[5]，母體羊水并非無(wú)菌，母體與胎兒之間存在微生物傳播的可能機(jī)制[6-7]。而這種可能在妊娠小鼠及孕婦中得到了證實(shí)。Walker等[8]給懷孕的小鼠口服熒光標(biāo)記糞腸球菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，其子代小鼠胎便中分離出帶標(biāo)記的糞腸球菌，而對(duì)照組(未口服熒光標(biāo)記糞腸球菌)小鼠子代則未檢測(cè)出熒光標(biāo)記的糞腸球菌。張燁等[9]研究給孕婦服用益生菌，在子代的胎便中也可以檢測(cè)到母體服用的益生菌?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】當(dāng)前，關(guān)于哈薩克羊母羊分娩前及胎兒相關(guān)部位細(xì)菌多樣性的研究鮮見(jiàn)。研究分娩前哈薩克母羊和胎兒組織、腸道內(nèi)容物及相關(guān)器官菌群的多樣性。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以分娩前哈薩克妊娠母羊?yàn)檠芯繉?duì)象，采用屠宰試驗(yàn)，研究母、胎相關(guān)組織、器官菌群結(jié)構(gòu)和多樣性，為進(jìn)一步揭示母胎間微生物傳播的可能及調(diào)控新生羔羊腸道菌群定殖提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

選擇5只4歲、平均體重(55.64±4.37) kg的健康妊娠后期的哈薩克母羊，所有試驗(yàn)動(dòng)物在同一飼養(yǎng)環(huán)境下舍飼飼養(yǎng)。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將5只妊娠后期哈薩克母羊安樂(lè)死，頸部放血，在屠宰前用無(wú)菌脫脂棉，采集母羊唾液后。根據(jù)解剖生理學(xué)，將母羊解剖，并獲取相關(guān)組織和樣品。

1.2.2 樣品采集

1.2.2.1 母羊唾液(SA)樣品采集

將無(wú)菌脫脂棉放入母羊口腔，蘸取母羊唾液后，立即裝入10 mL無(wú)菌凍存管，液氮冷凍，待測(cè)。

1.2.2.2 羊水(AF)樣品采集

將母羊解剖后，分離子宮，用50 mL的無(wú)菌注射器抽取羊水，立即轉(zhuǎn)入50 mL無(wú)菌凍存管內(nèi)，液氮冷凍，待測(cè)。

1.2.2.3 臍帶(UC)樣品采集

用無(wú)菌手術(shù)剪刀剪取臍帶約10 cm，立即裝入50 mL無(wú)菌凍存管內(nèi)，液氮冷凍，待測(cè)。

1.2.2.4 母羊瘤胃液(RU)樣品采集

將母羊瘤胃打開(kāi)，將瘤胃內(nèi)容物倒入滅菌的過(guò)濾袋內(nèi)，收集濾液，混勻后，采集50 mL于無(wú)菌凍存管內(nèi)，液氮冷凍，待測(cè)。

1.2.2.5 母羊小腸內(nèi)容物(SI)樣品采集

分離母羊小腸，并收集全部小腸內(nèi)容物于滅菌燒杯，混合均勻后，采集20 g于無(wú)菌凍存管內(nèi)，液氮冷凍，待測(cè)。

1.2.2.6 母羊盲腸內(nèi)容物(CE)樣品采集

分離母羊盲腸，并收集全部盲腸內(nèi)容物于滅菌燒杯，混合均勻后，采集20 g于無(wú)菌凍存管內(nèi)，液氮冷凍，待測(cè)。

1.2.2.7 羔羊瘤胃內(nèi)容物(RF)樣品物采集

將羔羊從胎盤(pán)內(nèi)剝離，解剖分離瘤胃，將全部瘤胃內(nèi)容物收集于50 mL無(wú)菌凍存管內(nèi)，液氮冷凍，待測(cè)。

1.2.2.8 羔羊胎糞(ME)樣品采集

分離胎兒的結(jié)腸和直腸，采集全部?jī)?nèi)容物于50 mL無(wú)菌凍存管內(nèi)，液氮冷凍，待測(cè)。

1.2.3 樣品檢測(cè)

1.2.3.1 樣品DNA提取及PCR擴(kuò)增

取大約0.25 g樣品采用十六烷基三甲基溴化銨法(Hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB)提取樣本的基因組DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純度和濃度，稀釋至1 ng/μL備用。以稀釋后的基因組DNA為模板，使用16S rDNA的V4區(qū)特異引物515F和806R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.3.2 PCR產(chǎn)物的混樣和純化

PCR產(chǎn)物用2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，混勻后用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，回收目標(biāo)條帶。

1.2.3.3 文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序

使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)檢測(cè)合格后，使用Hiseq 2500 PE250上機(jī)測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出樣品數(shù)據(jù)，然后截去Barcode和引物序列用于拼接，得到的拼接序列為原始數(shù)據(jù)。參照Qiime的質(zhì)量控制流程，將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行截取，并過(guò)濾掉其中連續(xù)高質(zhì)量堿基長(zhǎng)度小于序列長(zhǎng)度75%的數(shù)據(jù)。經(jīng)過(guò)以上處理后得到的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)并去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)。

利用Uparse軟件得到的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)，以97%的一致性將序列聚類(lèi)為OTUs(Operational Taxonomic Units)。采用RDP Classifier方法與GreenGene數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋分析(閾值設(shè)定為0.8～1)，分別在門(mén)(Phylum)、科(Family)和屬(Genus)的分類(lèi)水平上統(tǒng)計(jì)樣本的群落組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 多樣性分析

研究表明，在羔羊瘤胃內(nèi)容物、羔羊胎糞、羊水及母羊唾液發(fā)現(xiàn)數(shù)量較多的物種。母羊唾液、小腸和盲腸內(nèi)容物、羊水及羔羊胎糞中有較高的shannon指數(shù)，分別為7.22、6.39、6.81、6.50、6.25。chao1和ACE指數(shù)在母羊唾液、小腸內(nèi)容物和羊水中較高，分別為1 042.02、1 058.31、1 011.22和1 069.18、1 067.41、1 014.17。表1

表1 OTUs數(shù)量及α-多樣性

2.2 門(mén)水平菌群豐度

研究表明，厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)在母羊和胎兒各組織器官種內(nèi)容物中占比最高，細(xì)菌數(shù)量總和占菌數(shù)量的80%以上。羊水中藍(lán)細(xì)菌豐度較高為29.44%；在母羊口腔和胎兒瘤胃中變形菌門(mén)的豐度分別為41.92%和64.92%，高于母羊和胎兒其他組織器官中細(xì)菌的占比；在臍帶、羊水、胎兒瘤胃內(nèi)容物和胎糞中發(fā)現(xiàn)了占比較高的放線菌門(mén)，分別為10.43%、8.20%、6.61%和3.44%。厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)在母羊瘤胃中分別為30.89%和51.810%，而在胎兒瘤胃中分別為10.37%和10.73%。表2

表2 門(mén)水平豐度前10的物種

2.3 科水平菌群豐度

研究表明，鞘酯菌科在胎兒瘤胃、胎糞及臍帶中有較高的豐度，分別為55.31%、9.07%和2.19%。在母羊的唾液、臍帶和胎糞中檢測(cè)到豐富的莫拉菌科，分別為25.92%、8.43%和12.01%。在母羊和胎兒所有組織器官中均檢測(cè)出較為豐富的瘤胃菌科、普雷沃氏菌科和毛螺菌科，其中瘤胃菌科在母羊小腸和盲腸內(nèi)容物中分別為34.67%和41.14%，普雷沃氏菌科在母羊唾液和瘤胃液中分別為14.40%和25.32%，毛螺菌科在母羊盲腸內(nèi)容物、臍帶及胎糞中分別為13.74%、8.86%和8.08%。此外，在母羊唾液中奈瑟氏菌科豐度為8.87%，母羊瘤胃液中琥珀酸弧菌科和理研菌科豐度分別為12.93%和10.43%，母羊小腸中腸桿菌科豐度為8.92%，母羊盲腸內(nèi)容物中琥珀酸弧菌科豐度為8.82%。表3

表3 科水平豐度排在前10的物種豐度

2.4 屬水平菌群豐度

研究表明，在母羊唾液中檢測(cè)出豐度較高M(jìn)oraxella(20.37%)、絲狀小鏈菌(5.44%)、不動(dòng)細(xì)菌屬(4.28%)、單胞菌(4.29%)、鏈球菌屬(4.15%)和梭桿菌屬(3.18%)。母羊瘤胃液中檢測(cè)出豐度較高的Succinivibrio(10.04%)和unidentified_Bacteroidales(4.83%)。在母羊小腸內(nèi)容物中檢測(cè)到豐度較高unidentified_Ruminococcaceae(16.50%)、Romboutsia(6.00%)和Candidatus_Saccharimonas(3.23%)。在母羊盲腸內(nèi)容物中檢測(cè)到豐度較高的Succinivibrio(8.79%)、Faecalibacterium(12.45%)、擬桿菌屬(5.74%)、羅斯氏菌屬(3.84%)及Erysipelatoclostridium(2.42%)。在羔羊瘤胃液中檢測(cè)到占比55.17%Sphingomonas。在羔羊胎糞中分別檢測(cè)到豐度較高的Moraxella(5.37%)、Faecalibacterium(3.88%)、巨單胞菌屬(4.56%)、慢生根瘤菌屬(3.05%)及羅斯氏菌屬(3.32%)。在臍帶中檢測(cè)出豐度較高的嗜冷桿菌(10.11%)、Faecalibacterium(4.03%)、雙歧桿菌屬(3.75%)、肉桿菌屬(3.62%)、Jeotgalicoccus(3.65%)、擬桿菌屬(2.48%)及鏈球菌屬(4.27%)。在羊水中檢測(cè)到豐度較高的unidentified_Cyanobacteria(29.44%)、海桿菌屬(5.37%)及Ignatzschineria(3.50%)。圖1

注：嗜冷桿菌(Psychrobacter)、絲狀小鏈菌(Alysiella)、巨單胞菌屬(Megamonas)、不動(dòng)細(xì)菌屬(Acinetobacter)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、肉桿菌屬(Atopostipes)、單胞菌(Porphyromonas)、擬桿菌屬(Bacteroides)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、放線桿菌屬 (Actinobacillus)、海桿菌屬(Marinobacter)、羅斯氏菌屬(Roseburia)、罕見(jiàn)小球菌屬(Subdoligranulum)、鏈球菌屬(Streptococcus)、梭桿菌屬(Fusobacterium)

2.5 類(lèi)聚圖

研究表明，羔羊瘤胃液、胎糞及臍帶中物種相似性較高，母羊唾液和瘤胃液中物種相似性較高，母羊小腸內(nèi)容物和母羊盲腸內(nèi)容物中物種相似性較高，而羊水中物種的與其他組織相似性較低。圖2

注：分別是厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、梭桿菌門(mén)(Fusobacteria)、unidentified_Bacteria、軟壁菌門(mén)(Tenericutes)、迷蹤菌門(mén)(Elusimicrobia)及螺旋體門(mén)(Spirochaetes)

3 討 論

母體微生物在一定程度上影響胎兒的發(fā)育及健康[10]，這種影響在早期的研究中認(rèn)為是通過(guò)微生物代謝產(chǎn)生各類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)影響胎兒健康的[11-12]。起初研究中，認(rèn)為動(dòng)物胎盤(pán)、羊水是無(wú)菌的，胎盤(pán)中細(xì)菌可能是生殖道感染引起的[13-44]。Kovalovszki等[15]的研究結(jié)果首次證明母體胎盤(pán)中存在一定量的需氧細(xì)菌，并發(fā)現(xiàn)無(wú)任何感染的胎盤(pán)絨毛膜中仍然存在一定的細(xì)菌，胎盤(pán)及羊水中的細(xì)菌與產(chǎn)道是否炎癥無(wú)關(guān)。Walker等[8]及張燁等[9]研究證實(shí)母體與胎兒之間存在微生物傳播的可能。胎兒在孕期已經(jīng)具備從母體獲得微生物的可能。

結(jié)果顯示，胎兒瘤胃內(nèi)容物、胎糞及羊水、臍帶中均存在細(xì)菌多樣性，shannon、Simpson、chao1、ACE指數(shù)與母羊唾液、瘤胃液、小腸和盲腸內(nèi)容物相似。姚雪等[16]報(bào)道，孕婦在妊娠期腸道中α-菌群多樣性降低，β-菌群多樣性升高；在陰道中α-、β-菌群多樣性均降低。試驗(yàn)在母羊唾液、小腸內(nèi)容物和羊水中chao1、ACE指數(shù)均在1 000以上，孕期母羊唾液、小腸內(nèi)容物和羊水中菌群多樣性較高。臨產(chǎn)前的羔羊在母體胎盤(pán)中已經(jīng)感染了一定量的微生物，母體與胎兒之間具備微生物傳播的機(jī)制，這與姚雪等[16]報(bào)道一致，妊娠期人的胎盤(pán)并非無(wú)菌，而是存在一定的耗氧菌和厭氧菌，且羊水中存在細(xì)菌已被逐漸證明。

在門(mén)水平胎兒各組織器官分別檢測(cè)到豐度較高的厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、梭桿菌門(mén)(Fusobacteria)、unidentified_Bacteria、軟壁菌門(mén)(Tenericutes)、迷蹤菌門(mén)(Elusimicrobia)及螺旋體門(mén)(Spirochaetes)。在母羊的小腸、盲腸內(nèi)容物和臍帶中檢測(cè)到豐度較高的厚壁菌門(mén)(分別為79.08%、65.95%及49.66%)；擬桿菌門(mén)在母羊瘤胃內(nèi)容物中最高為51.80%。Koren等[17]為了研究妊娠早期和后期腸道菌群豐度差異，將這2個(gè)階段腸道菌接種到無(wú)菌小鼠的腸道內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，妊娠早期腸道菌群以厚壁菌門(mén)菌(Firmicutes)和擬桿菌門(mén)菌(Bacteroidetes)為主，變形菌門(mén)比例非常少；而妊娠后期變形菌門(mén)菌豐度較高，厚壁菌門(mén)菌和擬桿菌門(mén)菌的豐度占比明顯減少。試驗(yàn)中妊娠母羊唾液和胎兒瘤胃中變形菌門(mén)的豐度分別為41.92%和64.92%，相應(yīng)厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)豐度降低，這一結(jié)果與Koren等研究結(jié)果不同，可能與研究對(duì)象、日糧結(jié)構(gòu)類(lèi)型等有關(guān)。Kovalovszki等[15]通過(guò)培養(yǎng)的方法，首次在胎盤(pán)樣本中發(fā)現(xiàn)需氧細(xì)菌，并發(fā)現(xiàn)即使在沒(méi)有任何絨毛膜羊膜炎組織學(xué)證據(jù)的胎盤(pán)中，細(xì)菌仍然是存在的，且胎盤(pán)微生物主要是變形菌門(mén)。胎盤(pán)微生物組成與口腔微生物最為相似，都有較高含量的普氏桿菌和奈瑟氏菌[18]。試驗(yàn)結(jié)果中母羊唾液中門(mén)水平菌群豐度比例與臍帶和胎糞的相似度較高。有研究表明，革蘭陰性的口腔厭氧菌具核梭桿菌存在黏附素FadA ，它能夠與血管內(nèi)皮的鈣黏蛋白結(jié)合，改變血管內(nèi)皮的滲透壓，從而使得其他微生物種群，如大腸埃希菌等更輕易地穿過(guò)血管內(nèi)皮屏障[19]?？梢越忉尶谇痪号c胎盤(pán)菌群相似性高的原因。

早期研究認(rèn)為胎糞是無(wú)菌的，但最近的研究顯示，胎糞中檢測(cè)到一定量的腸球菌、腸桿菌、明串珠菌屬、乳球菌屬和鏈球菌等[20]。與成年糞便樣品菌群相比較，胎糞微生物多樣性較低，個(gè)體間的差異更高，擬桿菌門(mén)整體減少，但變形桿菌富集增加，這與試驗(yàn)在胎糞中檢測(cè)到豐度較高變形菌門(mén)結(jié)果相一致。

4 結(jié) 論

母羊妊娠后期唾液、小腸內(nèi)容物及羊水中有較高的chao1和ACE指數(shù)分別是104.02、1 058.31、1 011.22和1 069.18、1 067.41、1 014.17；母羊唾液中變形菌門(mén)和莫拉菌科豐度最高，分別為41.92%和25.92%；瘤胃液中擬桿菌門(mén)和普雷沃氏菌科分別為51.80%和25.32%；母羊小腸和盲腸內(nèi)容物中厚壁菌門(mén)和瘤胃菌科分別為79.08%、65.95%和34.67%、41.14%；羔羊瘤胃液中變形菌門(mén)和鞘酯菌科分別為64.92%和55.31%；羔羊胎糞和臍帶中厚壁菌門(mén)分別為35.69%和49.66%。厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)及擬桿菌門(mén)是此階段母羊和胎兒各組織器官主要的物種。