馬銘澤，史鳳顯，翟若南，王 航，李 珂，許春艷，牛 淑，姚 武，周 舫

鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與職業(yè)病學(xué)教研室 鄭州 450001

肺癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程往往伴隨著上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)進(jìn)程[1-2]。EMT上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生向間(充)質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變并獲得遷移能力，在胚胎生長、組織重塑、腫瘤轉(zhuǎn)移等過程中起著至關(guān)重要的作用[3-4]。EMT被認(rèn)為是組織、器官等纖維化進(jìn)程的主要原因，也是增強(qiáng)肺癌細(xì)胞侵襲其他器官和轉(zhuǎn)移能力的重要過程[5]。因此，探討肺癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程對于肺癌的防治具有重要意義。

轉(zhuǎn)化生長因子β( transforming growth factor β，TGF-β)是一種多功能細(xì)胞因子，在細(xì)胞和組織的生長、發(fā)育、分化中起關(guān)鍵作用，對細(xì)胞的增殖、分化、凋亡，細(xì)胞間質(zhì)產(chǎn)生，胚胎發(fā)育，器官形成，免疫功能，炎癥反應(yīng)，創(chuàng)傷修復(fù)等有重要的調(diào)節(jié)作用，同時可以誘導(dǎo)細(xì)胞EMT[6-7]。熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是細(xì)胞在受到高溫刺激及其他環(huán)境因素如毒素、氧壓、營養(yǎng)缺乏、重金屬、強(qiáng)紫外線照射等刺激后，所產(chǎn)生的高度保守并具有防御作用的一組蛋白質(zhì)[8-9],對細(xì)胞的分化、增殖等過程具有調(diào)節(jié)作用。研究[10-11]發(fā)現(xiàn)替普瑞酮作為HSP70誘導(dǎo)劑，在大鼠胃黏膜細(xì)胞中能誘導(dǎo)HSP70高表達(dá)并對細(xì)胞起到保護(hù)作用，并在其他器官中如心、腦、肝等組織中也有相同的作用。本研究選擇用TGF-β刺激A549細(xì)胞建立EMT細(xì)胞模型，用替普瑞酮誘導(dǎo)HSP70高表達(dá)，探討HSP70在TGF-β誘導(dǎo)的人肺腺癌A549細(xì)胞EMT進(jìn)程的作用，為肺癌的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與主要試劑人肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞購自中國科學(xué)院。二甲基亞砜(DMSO)、RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基(北京索萊寶科技有限公司)，胎牛血清(美國GEMINI公司)，TGF-β(美國Peprotech公司)，替普瑞酮(美國MCE生物公司)，HSP70、E-cadherin、Vimentin蛋白一抗(按1∶1 000稀釋，美國Cell Signaling Technology公司)，GAPDH一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，倒置顯微鏡(日本Nikon公司)，DYCZ-24DN電泳儀(北京六一儀器廠)，自動酶標(biāo)儀(美國Bio Teck公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)采用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清和含青霉素、鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2、95%濕度條件下，對A549細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、傳代、培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到80%融合時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3替普瑞酮誘導(dǎo)A549細(xì)胞HSP70表達(dá)的最佳作用條件用0、25、50、100、200 μmol/L的替普瑞酮處理A549細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞提取蛋白，采用Western blot法檢測HSP70的表達(dá)，同時利用細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)檢測A549細(xì)胞的活性，篩選出替普瑞酮誘導(dǎo)HSP70高表達(dá)的最佳作用條件。

1.4實(shí)驗(yàn)分組將A549細(xì)胞分為4組：對照組，只加入RPMI 1640培養(yǎng)基；TGF-β組，加入5 μg/L的TGF-β和RPMI 1640培養(yǎng)基；TGF-β+替普瑞酮組，加入5 μg/L的TGF-β、50 μmol/L的替普瑞酮和RPMI 1640培養(yǎng)基；替普瑞酮組，加入50 μmol/L的替普瑞酮和RPMI 1640培養(yǎng)基。作用24 h后，收集細(xì)胞。

1.5EMT相關(guān)蛋白E-cadherin和Vimentin的Westernblot檢測將A549細(xì)胞接種到6孔板中，待細(xì)胞融合達(dá)80%后，清洗細(xì)胞，并根據(jù)1.4中實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行相應(yīng)處理。24 h后，收集細(xì)胞，用含PMSF的裂解液提取蛋白，將蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液混合煮沸5 min變性。之后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。PVDF膜用50 g/L脫脂奶粉混合TBST緩沖液封閉2 h，4 ℃下與一抗孵育12 h，用TBST緩沖液漂洗后加入二抗，置于搖床上常溫慢速孵育 2 h，洗膜后用超敏ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑顯影并曝光。利用Quantity One軟件定量分析條帶的灰度值。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6遷移能力檢測將A549細(xì)胞接種到到6孔板中，待細(xì)胞融合達(dá)80%后，用槍頭在6孔板中間細(xì)胞表面做一條劃痕，用PBS緩沖液清洗3遍，并在顯微鏡(×100)下觀察細(xì)胞形態(tài)及劃痕寬度，不同組別分別處理24 h，再于顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照，對圖片用Photoshop軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用相對寬度來表示。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行分析。不同濃度替普瑞酮誘導(dǎo)A549細(xì)胞后的細(xì)胞活性、4組細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)和細(xì)胞遷移能力的比較采用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1替普瑞酮最佳作用條件與0 μmol/L替普瑞酮處理比較，20、50 μmol/L替普瑞酮處理的A549細(xì)胞HSP70的表達(dá)升高(圖1、表1)；結(jié)合不同濃度替普瑞酮處理對細(xì)胞活性的影響，選擇50 μmol/L的替普瑞酮進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1～5：分別為0、25、50、100和200 μmol/L的替普瑞酮處理

表1 不同濃度替普瑞酮處理對A549細(xì)胞HSP70表達(dá)和細(xì)胞活性的影響(n=3 )

2.2 4組A549細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的比較見圖2、表2。替普瑞酮促使A549細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)升高，Vimentin蛋白表達(dá)下降；TGF-β促使E-cadherin蛋白表達(dá)降低，Vimentin蛋白表達(dá)升高。替普瑞酮可拮抗TGF-β的作用。

1～4：分別為對照組、TGF-β組、TGF-β+替普瑞酮組和替普瑞酮組

2.3 4組細(xì)胞遷移能力比較見表2。TGF-β促使A549細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)；替普瑞酮促使細(xì)胞遷移能力下降；替普瑞酮可拮抗TGF-β的作用。

表2 4組細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)和細(xì)胞遷移能力的比較(n=3)

3 討論

目前，肺癌在全球范圍內(nèi)的病例和死亡人數(shù)依然呈上升趨勢，肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散是導(dǎo)致肺癌患者死亡的首要原因[1]。因此，控制肺癌細(xì)胞向機(jī)體其他器官的遷移和擴(kuò)散是治療肺癌的重要措施[12]。EMT是肺癌細(xì)胞遷移發(fā)生的關(guān)鍵點(diǎn)，這個過程中胞質(zhì)骨架會重新構(gòu)建，細(xì)胞間的連接能力減弱，進(jìn)而促進(jìn)了細(xì)胞的遷移[13]。目前的研究[14-15]表明，EMT在多種細(xì)胞的遷移過程起到了很大的作用。

本研究結(jié)果顯示25、50 μmol/L替普瑞酮處理的A549細(xì)胞中HSP70蛋白的表達(dá)均升高；結(jié)合不同濃度替普瑞酮處理對A549細(xì)胞活性的影響，我們選擇50 μmol/L替普瑞酮進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

HSP70作為HSP家族的核心成員而被廣泛研究，作為分子伴侶它參與蛋白的折疊、成熟過程。研究[16]發(fā)現(xiàn)，在大鼠腹膜間質(zhì)細(xì)胞中，HSP70能作用于MAPK/ERK和TGF-β/SMAD信號通路，進(jìn)一步抑制由糖基化最終產(chǎn)物誘導(dǎo)的細(xì)胞EMT進(jìn)程；HSP70也能通過減弱TGF-β介導(dǎo)的SMAD2磷酸化進(jìn)而調(diào)控HEK293T和HaCaT細(xì)胞的EMT進(jìn)程[17]，因此我們推測高表達(dá)的HSP70對A549細(xì)胞的EMT進(jìn)程也起到抑制作用。EMT進(jìn)程中，常伴隨著E-cadherin蛋白表達(dá)降低而Vimentin蛋白表達(dá)增加[3]。本研究結(jié)果顯示，TGF-β促使A549細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)降低，Vimentin蛋白表達(dá)升高；替普瑞酮拮抗了這一作用。HSP70或許成為一個可以調(diào)控的潛在靶點(diǎn)進(jìn)而影響A549細(xì)胞的EMT進(jìn)程。

有研究[18]表明，HSP70參與了細(xì)胞的遷移進(jìn)程，如在HeLa細(xì)胞中，沉默HSP70 的表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞的遷移[19]；在人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞中，高表達(dá)的HSP70能夠有效抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生進(jìn)而抑制細(xì)胞的遷移作用[20]；但是在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，HSP70的高表達(dá)對細(xì)胞的遷移有著促進(jìn)作用[21]，可能是不同種類的細(xì)胞導(dǎo)致的差異。本研究結(jié)果顯示，TGF-β促使A549細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，替普瑞酮拮抗了這一作用，這與在HeLa細(xì)胞和人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的，提示HSP70可能作為抑制細(xì)胞遷移的重要靶點(diǎn)。

綜上所述，在TGF-β誘導(dǎo)的A549細(xì)胞模型中，高表達(dá)的HSP70能抑制A549細(xì)胞EMT進(jìn)程，并減弱細(xì)胞遷移能力。