原發(fā)性肝癌患者外周血單個核細胞線粒體DNA含量檢測及其臨床意義

廖新愛 馮惠娟 卓傳尚 葉治 柳麗娟

在肝癌早期及預后診斷中缺乏靈敏度和特異度高的診斷標志物[1]，因此評估肝癌風險亟需新的替代或聯合檢測標志物。

線粒體含有獨立于核基因組的DNA，稱為線粒體DNA(mtDNA)。由于mtDNA沒有組蛋白，缺乏抗氧化機制以及有效的修復系統，因此各種刺激因子的作用容易引起mtDNA產生突變或含量變化，并與癌癥的發(fā)生及發(fā)展密切相關[2]。目前，mtDNA含量相關研究主要集中在癌組織以及外周血單核細胞(peripherali blood mono-nuclear cell,PBMC)，PBMC mtDNA在一定程度上可以反映組織中mtDNA含量的變化，可用來監(jiān)測線粒體的損傷以及疾病的發(fā)展情況。已有研究發(fā)現，PBMC mtDNA含量變化與糖尿病、尿毒癥、膿毒血癥以及多種腫瘤發(fā)生及病死率相關，可作為潛在的生物標志物[3-5]。本研究通過實時熒光定量PCR檢測PLC患者及健康人群PBMC中mtDNA變化趨勢，探討PBMC mtDNA在肝癌診斷中的臨床意義。

資料與方法

一、研究對象

收集2018年9月至2019年11月在福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院住院治療的PLC患者250例，同期收集健康獻血者48名為健康對照。PLC患者的診斷標準參照《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》。收集所有研究對象臨床信息及實驗室指標[總膽紅素(TBil)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、甲胎蛋白(AFP)、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)及乙型肝炎e抗原(HBeAg)等]。本研究通過福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院倫理委員會批準并獲得研究對象知情同意。

二、檢測方法及儀器

AU5800全自動生化儀檢測血清TBil、ALT、AST等生化指標(美國貝克曼庫爾特公司)；ARCHITECT i2000Sr全自動免疫分析儀檢測HBV標志物(美國雅培有限公司)；G1200檢測AFP(日本富士科技有限公司)。

三、PBMC mtDNA提取及含量測定

取EDTA-K2抗凝血5 mL，采用人外周血淋巴細胞分離液(Ficoll 1.077 g/mL購自GIBCO公司)提取PBMC，基因組DNA(包括mtDNA)的提取參照DNA提取試劑盒說明書(購自中國北京全式金生物技術有限公司)。通過NADH脫氫酶亞基 1(ND1)來確定mtDNA的含量，選用β-globin作為內參基因，ND1以及β-globin引物序列參見文獻[6]，引物序列見表1(引物序列由中國福州尚亞生物技術有限公司合成)。實時熒光定量PCR反應體系為25 μL：SYRB的PCR混合液12.5 μL，50×ROX II 0.25 μL，10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，滅菌ddH2O 10.25-VDNA μL，模板DNA 20 ng。擴增條件為：95℃ 20 s預變性，95℃ 3 s，58℃ 30 s 進行30個循環(huán)。線粒體DNA相對含量表示為2-[Ct(ND1)-Ct(β-globin)]，其中Ct代表標本擴增曲線中循環(huán)閾值。

表1 PCR引物序列及片段長度

四、統計學分析

結 果

一、臨床特征

250例PLC患者中，HBsAg陽性233例(93.20%)，HBeAg陽性39例(16.74%)，HBeAg陰性194例(83.26%)。210例(84.00%)有肝硬化背景。PLC患者的男性占比、年齡、血清膽紅素、總蛋白、白蛋白、血清酶學、AFP相對含量均高于健康人群。見表2。

表2 PLC患者及健康人群臨床特征比較

二、實時熒光定量PCR擴增結果

PBMC提取的DNA與相對應的引物進行實時熒光定量PCR，結果顯示，所有標本mtDNA與核DNA PCR擴增曲線均呈現S形，表明所有樣品的目的產物呈指數擴增，即擴增效率為100%，擴增反應良好，陰性對照無擴增，檢測結果可靠。

三、PLC患者和健康人群PBMC mtDNA 相對含量的比較

分析PLC患者和健康人群PBMC mtDNA ND1基因的相對含量，結果顯示：PLC患者PBMC mtDNA相對含量為90.51 (49.78,165.44)，顯著低于健康人群的456.67(2446.47，1017.60)，差異有統計學意義(W=32579.00，P<0.01)。

四、PLC患者中mtDNA與性別、年齡、HBsAg、肝硬化背景及AFP的相關分析

由于PBMC mtDNA為非正態(tài)分布連續(xù)性資料，采用Spearman進行相關分析，結果顯示，PLC患者中PBMC mtDNA與性別、年齡、HBsAg、肝硬化背景及AFP的P值分別為：0.671、0.284、0.184、0.397、0.832，差異無統計學意義。提示PBMC mtDNA與患者的性別、年齡、HBsAg、肝硬化背景及AFP均無相關性。

五、PBMC mtDNA診斷效能評估

ROC曲線分析結果顯示，mtDNA診斷PLC的AUC為0.884，高于AFP的0.863，但差異無統計學意義(Z=0.493，P=0.622)。mtDNA診斷PLC的最佳cut-off值為F≤164.28，靈敏度為75.20%，略高于AFP的71.70%。mtDNA與AFP二者聯合診斷可以顯著提高診斷性能，AUC達0.957，高于mtDNA或AFP單獨檢測時的效能(z值分別為3.485和1.25，均P<0.01)，靈敏度提高到84.91%，而特異度雖稍降但仍高達93.18%，見表3。

表3 mtDNA、AFP及二者聯合檢測診斷PLC的性能

討 論

研究發(fā)現，肝癌患者PBMC mtDNA含量顯著降低，提示mtDNA可能是潛在的肝癌標志物[6-8]。本研究結果顯示PLC患者PBMC mtDNA相對含量低于對照組，與文獻報道一致。ROC曲線分析結果顯示，雖然AFP有較高的AUC和特異度，但是靈敏度只有71.7%，相比較而言，mtDNA用于診斷PLC時，具有較高的AUC(0.884)和靈敏度(75.20%)。相關性分析顯示，mtDNA與AFP不相關，可以互補，二者聯合檢測可大大提高對PLC的診斷性能，AUC提高到0.957，靈敏度達到84.91%，而特異度略微降低，仍高達93.18%。

mtDNA作為獨立于細胞核染色體外的基因組，受到損傷后其基因發(fā)生突變或水平出現變化[9]。最近研究發(fā)現，mtDNA含量的增加與罹患非霍奇金淋巴瘤、肺癌、結直腸癌、乳腺癌具有相關性，mtDNA含量減少則可增加罹患軟組織肉瘤的風險[10-13]。氧化應激可引起mtDNA含量變化，mtDNA D-環(huán)區(qū)對氧化應激敏感，易發(fā)生基因突變等損傷，進而導致mtDNA含量下降或改變，白細胞的mtDNA含量受血液循環(huán)中血漿抗氧化劑/氧化劑以及DNA氧化損傷所引起的氧化應激的影響[14-16]。另外，細胞自噬也參與mtDNA含量的調控，高水平的活性氧(ROS)引起mtDNA損傷，間接引起mtDNA含量的下降[17]。PLC患者PBMC的mtDNA含量降低可能通過改變細胞能量代謝及機體抗氧化水平進而影響腫瘤免疫。但是，關于肝癌患者的PBMC mtDNA含量下降的具體調控機制目前尚不清楚，有待下一步深入研究。

本研究為單中心的橫斷面研究，可能存在樣本、疾病譜偏差，且缺少相應的肝炎和肝硬化患者的隊列作為相應的對照等，后續(xù)需要進一步擴大樣本及進行多中心研究加以驗證。總之，本研究的結果證實了PLC患者PBMC mtDNA含量較健康人群顯著下降，具有較高的臨床診斷價值，有望成為新的肝癌血清標志物以幫助臨床醫(yī)師在臨床實踐過程中對PLC做出診斷。