朱莉萍，賈春敏，陳南山

(1.武漢市金銀潭醫(yī)院 ICU，武漢 430040；2.武漢市金銀潭醫(yī)院 內(nèi)科，武漢 430040；3.武漢市金銀潭醫(yī)院 結(jié)核科，武漢 430040)

結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的致病菌，人體感染結(jié)核分枝桿菌后，大多數(shù)感染者處于潛伏狀態(tài)，約有5%的感染者出現(xiàn)臨床癥狀，這種差異主要是由宿主的免疫力不同引起的[1]。當(dāng)結(jié)核分枝桿菌經(jīng)呼吸道進(jìn)入肺組織時(shí)，肺泡中的巨噬細(xì)胞將通過吞噬作用控制或消除結(jié)核分枝桿菌的感染[2]。巨噬細(xì)胞表達(dá)的PRR在上述過程中具有重要作用，如細(xì)胞表面的TLR和細(xì)胞內(nèi)的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor，NLR)[3-4]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2(nucleotide binding oligomerization domain 2，NOD2)是NLR家族的成員。研究發(fā)現(xiàn)，NOD2可通過誘導(dǎo)一氧化氮和抗菌肽防御素4B的分泌參與人肺泡巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌感染的免疫過程[5]。鑒于炎癥反應(yīng)[6]和自噬[7]在巨噬細(xì)胞的免疫過程中具有重要作用，本研究利用人巨噬細(xì)胞U937對結(jié)核分枝桿菌的吞噬能力，試從炎癥反應(yīng)、自噬角度分析NOD2基因在巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌免疫反應(yīng)中的作用。

1 材料與方法

1.1 樣本來源及分組人巨噬細(xì)胞U937購自上海子實(shí)生物科技有限公司，結(jié)核分枝桿菌購自上海恒斐生物科技有限公司。以受結(jié)核分枝桿菌感染的U937細(xì)胞為感染組， 以未經(jīng)結(jié)核分枝桿菌感染的U937細(xì)胞為對照組。

1.2 試劑與儀器Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自GeneCopoeia公司，引物由蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成，ELISA試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司，蛋白一抗IL-6兔多克隆抗體、IL-8兔多克隆抗體、TNF-α抗體購自Proteintech公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱購自上海玉研科學(xué)儀器有限公司，酶標(biāo)儀、qRT-PCR儀購自BIORAD公司，全自動(dòng)凝膠成像儀購自北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，超凈工作臺購自江蘇蘇凈集團(tuán)，高壓滅菌鍋購自江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司，水浴鍋購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司，離心機(jī)購自SCILOGEX有限公司，移液槍購自Eppendorf公司，培養(yǎng)皿、無菌離心管、24孔板、96孔板購自Corning公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出U937細(xì)胞，置37 ℃水浴中快速解凍。低速離心后棄上清液，加入培養(yǎng)液吹打細(xì)胞，混勻后將其培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞密度過大時(shí)，吸出細(xì)胞液于離心管中，低速離心后棄上清液，加入新的培養(yǎng)液適度稀釋細(xì)胞，再將其轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期細(xì)胞，低速離心后棄上清液，將細(xì)胞重懸于細(xì)胞凍存液中，放入細(xì)胞凍存盒，于-80 ℃冰箱放置過夜，次日移入液氮罐中保存。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]合成NOD2 siRNA引物序列。將U937細(xì)胞以2×106個(gè)/mL密度接種于96孔板，參照Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書中的步驟進(jìn)行操作。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，將NOD2 siRNA和無序序列(NC)轉(zhuǎn)染至U937細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞，加入培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 內(nèi)吞細(xì)菌試驗(yàn) 采用平板劃線法得到結(jié)核分枝桿菌單個(gè)菌落，將結(jié)核分枝桿菌和轉(zhuǎn)染的細(xì)胞重懸于培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)菌密度(650 nm波長處的光密度約為0.6)。將處于對數(shù)生長期的U937細(xì)胞接種于24孔板(1×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)24 h，再更換為不含抗生素的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)30 min。將細(xì)菌以10∶1的比例與U937細(xì)胞混合，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。用預(yù)冷緩沖液沖洗細(xì)胞外細(xì)菌，并加入含有慶大霉素的培養(yǎng)液，殺死殘留在細(xì)胞膜上的細(xì)菌。

1.3.4 菌落計(jì)數(shù) 收集內(nèi)吞結(jié)核分枝桿菌的U937細(xì)胞，低速離心后棄上清液，裂解細(xì)胞，均勻涂板，于37 ℃培養(yǎng)12～24 h，觀察菌落生長情況并計(jì)數(shù)。計(jì)算U937細(xì)胞對結(jié)核分枝桿菌的殺傷率：48 h時(shí)的殺傷率為(lgN24 h-lgN48 h)/lgN24 h×100%，72 h時(shí)的殺傷率為(lgN24 h-lgN72 h)/lgN24 h×100%，N為平均菌落數(shù)。

1.3.5 U937細(xì)胞中NOD2 mRNA表達(dá)的qRT-PCR檢測 收集內(nèi)吞結(jié)核分枝桿菌的U937細(xì)胞，完全裂解細(xì)胞后，以氯仿-異丙醇體系提取細(xì)胞中總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增合成cDNA，混入SYBR GREEN Mix進(jìn)行qRT-PCR。根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]設(shè)計(jì)NOD2和GADPH的引物序列(表1)。參數(shù)設(shè)置：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性20 s、55 ℃退火20 s、72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法，以GADPH的表達(dá)為內(nèi)參，計(jì)算NOD2 mRNA的相對表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物

1.3.6 細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子水平的ELISA檢測 收集內(nèi)吞結(jié)核分枝桿菌的U937細(xì)胞上清液，根據(jù)ELISA試劑盒說明書中的步驟進(jìn)行操作，檢測細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8及TNF-α的水平。

1.3.7 細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的Western blotting檢測 收集內(nèi)吞結(jié)核分枝桿菌的U937細(xì)胞，充分裂解后以12 000×g離心10 min，取上清蛋白液。檢測蛋白濃度后取70 μg蛋白混入蛋白上樣緩沖液，置于100 ℃水浴變性10 min。配制10%濃縮膠和5%分離膠，進(jìn)行電泳。待蛋白完全分離后在冰上濕轉(zhuǎn)至PVDF膜。取出PVDF膜， 將其浸于5%脫脂牛奶中，室溫下孵育2 h，封閉非特異性位點(diǎn)。洗膜3次，置于相應(yīng)的蛋白一抗中，4 ℃孵育過夜。洗膜3次，浸于蛋白二抗中，37 ℃反應(yīng)40 min。洗膜3次，添加化學(xué)發(fā)光劑，應(yīng)用全自動(dòng)凝膠成像儀顯示蛋白條帶。以β-actin的表達(dá)為內(nèi)參，計(jì)算細(xì)胞中p62和微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3， LC3)的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞內(nèi)NOD2mRNA表達(dá)水平的比較采用qRT-PCR檢測各組細(xì)胞中NOD2 mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對照組比較，感染組U937細(xì)胞中NOD2 mRNA的表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)；與NC組比較，NOD2 siRNA組U937細(xì)胞中NOD2 mRNA的表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。(圖1)

注：與對照組比較，*P<0.05；與NC組比較，#P<0.05。圖1 各組細(xì)胞內(nèi)NOD2 mRNA表達(dá)水平的比較

2.2 NOD2對U937細(xì)胞吞噬能力的影響于吞噬24、48及72 h時(shí)收集細(xì)胞，檢測U937細(xì)胞中的結(jié)核分枝桿菌密度。與NC組比較，不同時(shí)間點(diǎn)NOD2 siRNA組U937細(xì)胞中的結(jié)核分枝桿菌密度明顯降低(P<0.05， 圖2)；吞噬48及72 h，NC組U937細(xì)胞對結(jié)核分枝桿菌的殺傷率分別為(38.41±5.69)%和(61.16±8.23)%，NOD2 siRNA組U937細(xì)胞對結(jié)核分枝桿菌的殺傷率分別為(36.98±5.27)%和(57.28±7.49)%，2組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

注：與NC組比較，*P<0.05。圖2 NOD2對U937細(xì)胞吞噬能力的影響

2.3 NOD2對U937細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子水平的影響與對照組比較，感染組上清液中IL-6、IL-8及TNF-α水平顯著上升(P<0.05)；與NC組比較，NOD2 siRNA組上清液中IL-6、IL-8及TNF-α水平顯著下降(P<0.05)。(圖3)

注：A.IL-6表達(dá)量；B.IL-8表達(dá)量；C.TNF-α表達(dá)量。與對照組比較，*P<0.05；與NC組比較，#P<0.05。圖3 NOD2對U937細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子水平的影響

2.4 NOD2對U937細(xì)胞自噬的影響與對照組比較，感染組U937細(xì)胞中p62、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ水平顯著上升(P<0.05)；而NC組與NOD2siRNA組U937細(xì)胞中p62、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ水平比較， 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(圖4)

注：A.p62、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ蛋白條帶圖；B.p62的相對表達(dá)量；C.LC3Ⅰ/LC3Ⅱ水平。與對照組比較，*P<0.05。圖4 NOD2對U937細(xì)胞自噬的影響

3 討論

巨噬細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，主要分布于肺泡上皮細(xì)胞表面，可通過自身的PRR對入侵的細(xì)菌產(chǎn)生免疫反應(yīng)[10]。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入人體后，會(huì)被巨噬細(xì)胞吞噬，巨噬細(xì)胞同時(shí)募集多種免疫細(xì)胞，形成結(jié)核性肉芽腫組織；若肉芽腫組織無法控制病原菌的復(fù)制，會(huì)形成干酪樣壞死結(jié)構(gòu)，并釋放被包裹著的病原菌，最終發(fā)展成結(jié)核病[11]。肉芽腫組織在結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展中具有雙重作用：一方面，肉芽腫組織可在一定程度上限制病原菌的復(fù)制、擴(kuò)散；另一方面，肉芽腫組織也有“屏蔽”其他免疫細(xì)胞及外源性藥物的作用[12]。而巨噬細(xì)胞不僅是結(jié)核分枝桿菌主要的效應(yīng)細(xì)胞，也是其主要的寄生場所。Gordon等[13]研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞功能與結(jié)核性肉芽腫組織的形成、轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞U937感染結(jié)核分枝桿菌后，細(xì)胞中NOD2 mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)，提示NOD2可能參與了U937細(xì)胞對結(jié)核分枝桿菌的免疫反應(yīng)，這與Landes等[14]的研究結(jié)果相符。

為進(jìn)一步探究NOD2在巨噬細(xì)胞吞噬結(jié)核分枝桿菌中的作用，本研究將NOD2 siRNA轉(zhuǎn)染U937細(xì)胞。結(jié)果顯示，沉默NOD2后U937細(xì)胞中NOD2 mRNA的表達(dá)水平顯著下降，這提示U937細(xì)胞中NOD2基因干擾成功。巨噬細(xì)胞抵抗病原菌感染時(shí)會(huì)分泌多種細(xì)胞因子，如IL-6、IL-8及TNF-α等，其中IL-6和TNF-α具有促炎作用，而IL-8屬于趨化因子，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞的聚集[15]。本研究結(jié)果顯示，沉默NOD2基因后U937細(xì)胞對結(jié)核分枝桿菌的吞噬能力及細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α的表達(dá)水平顯著下降，但其殺傷能力并無變化。這可能是因?yàn)榍玫蚇OD2的表達(dá)后，U937細(xì)胞的吞噬數(shù)量減少，使其效應(yīng)炎癥反應(yīng)強(qiáng)度減弱，不利于巨噬細(xì)胞殺傷結(jié)核分枝桿菌，這也再次驗(yàn)證了NOD2基因可影響巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌的免疫反應(yīng)，這一效應(yīng)可能與其介導(dǎo)炎癥反應(yīng)有關(guān)。

自噬是機(jī)體高度保守且受精密調(diào)控的過程，對于細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、生長分化等有重要作用。有效的自噬對巨噬細(xì)胞清除結(jié)核分枝桿菌至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌感染后會(huì)阻礙自噬體的融合與成熟，從而抑制細(xì)胞自噬[16]。LC3和p62在自噬體的形成過程中有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞感染結(jié)核分枝桿菌后，細(xì)胞中p62、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ水平顯著上調(diào)，這提示結(jié)核分枝桿菌感染會(huì)降低巨噬細(xì)胞的自噬水平。但沉默NOD2后，細(xì)胞中p62、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ水平無明顯變化，這提示NOD2在自噬過程中可能不發(fā)揮主要作用。

綜上所述，巨噬細(xì)胞感染結(jié)核分枝桿菌后，細(xì)胞中NOD2 mRNA的表達(dá)水平異常升高，而沉默NOD2 后巨噬細(xì)胞吞噬結(jié)核分枝桿菌的能力下降，這表明NOD2基因可能參與巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌的免疫過程，可能與誘導(dǎo)IL-6、IL-8及TNF-α的分泌有關(guān)。但人體免疫系統(tǒng)是一個(gè)復(fù)雜且精密的系統(tǒng)，NOD2在抗結(jié)核分枝桿菌感染中的免疫作用尚需利用動(dòng)物模型進(jìn)一步驗(yàn)證。