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      復(fù)幼顆粒提取工藝優(yōu)化及制劑處方研究

      2021-06-11 02:52:42龐琳諾馬葆睿張萌張歡覃柳瑩蔡夢如趙立波王曉玲倪健
      中醫(yī)藥學(xué)報(bào) 2021年5期

      龐琳諾,馬葆睿,張萌,張歡,覃柳瑩,蔡夢如,趙立波,王曉玲*,倪健

      (1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 102488;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院,北京 100045;3.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院,北京 100029)

      性早熟是一種常見的青春期發(fā)育異常疾病,在女童中的發(fā)病率遠(yuǎn)高于男童[1],性早熟兒童由于體內(nèi)性激素水平升高,性器官過早發(fā)育[2],體格加速增長、骨骺提前閉合,導(dǎo)致最終成人身高低于正常同齡人身高[3],隨著生活水平的提高,我國兒童性早熟發(fā)病率逐年上升[4],性早熟的預(yù)防和治療愈發(fā)受到人們的重視。

      復(fù)幼方為首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院的臨床經(jīng)驗(yàn)方,化裁自知柏地黃丸,經(jīng)劑型優(yōu)化制成。全方由鹽知母、生地黃、玄參、牡丹皮、關(guān)黃柏等11味中藥組合而成,具有滋補(bǔ)肝腎、清熱瀉火的作用,用于治療肝腎不足、陰虛火旺、肝郁化火所致女童性早熟,癥見乳房增大、白帶量多、陰道出血等效果顯著。原處方為合劑供患兒服用,療效確切[5],但存在攜帶和使用不便、口感較差、易發(fā)霉變質(zhì)等缺點(diǎn),將劑型制備成顆粒劑,載藥量大、穩(wěn)定性好,通過矯味可以提高患兒順應(yīng)性。

      本研究首先采用正交實(shí)驗(yàn),以芒果苷、芍藥苷含量及干膏得率為指標(biāo),優(yōu)選了加水倍量、提取時(shí)間和提取次數(shù),以指標(biāo)性成分的損失率為評價(jià)指標(biāo)對濃縮和干燥工藝進(jìn)行了考察,對輔料、潤濕劑和矯味劑種類及用量等進(jìn)行了優(yōu)選,并對顆粒吸濕性進(jìn)行考察,為復(fù)幼顆粒規(guī)?;a(chǎn)的控制條件提供參考。

      1 儀器和試藥

      1.1 儀器

      FW-200型粉碎機(jī)(北京科委永興儀器有限公司);ZDHW型電熱套(北京市中興偉業(yè)儀器有限公司);DZF-6050型干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);JY5002型電子天平(0.01 g,上海衡平儀器儀表廠);CPA225D型電子分析天平(0.01 mg,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司;LC-20AT型高效液相色譜儀(SPD-20A DAD檢測器,LC Solution色譜工作站,日本島津公司);DHG-9145A型鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、10目藥篩、80目藥篩、干燥器、稱量瓶、噴霧瓶等。

      1.2 試藥

      鹽知母、生地黃、玄參、牡丹皮、關(guān)黃柏等藥材均購自北京本草方源藥業(yè)有限公司。芒果苷(批號:111607-201704,純度:98.10%);芍藥苷(批號:110736-201842,純度:97.4%),均購自中國食品藥品檢定研究院。糊精、可溶性淀粉、乳糖、蔗糖、糖精鈉、阿斯帕坦均為藥用輔料,娃哈哈水、乙腈和甲醇為色譜純,實(shí)驗(yàn)用水為高純水,其余化學(xué)試劑為分析純。

      2 方法與結(jié)果

      2.1 提取工藝

      2.1.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

      全方采用水提工藝,以芒果苷及芍藥苷提取率為考察指標(biāo),設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選最佳水提工藝。因素水平見表1。

      表1 因素水平表

      2.2 提取液中芒果苷和芍藥苷含量測定

      2.2.1 色譜條件

      流動(dòng)相:乙腈-0.2%醋酸溶液(9:91),檢測波長:258、 230 nm,流速:1.0 mL·min-1,進(jìn)樣量:10 μL。此條件下對照品溶液和供試品溶液的HPLC圖,見圖1和圖2。

      注:A:對照品溶液;B:供試品溶液;1:芒果甘。圖1 芒果苷HPLC圖

      注:A:對照品溶液;B:供試品溶液;1:芍藥苷。圖2 芍藥苷HPLC圖

      2.2.2 對照品溶液的制備

      精密稱取芒果苷對照品和芍藥苷對照品適量,分別加甲醇制成濃0.050 33 mg/mL的芒果苷對照品溶液和0.059 80 mg/mL的芍藥苷對照品溶液。

      2.2.3 供試品溶液的制備

      按照處方比例稱取藥材,加水進(jìn)行提取、濾過,放冷定容,搖勻,靜置。取少量過0.45 μm微孔濾膜,即得。

      2.2.4 陰性供試品溶液的制備

      按照處方比例稱取藥材兩份,一份不含知母,另一份不含牡丹皮,其余按照上述供試品溶液的制備方法,即得。

      2.3 水提取正交試驗(yàn)及結(jié)果

      按處方比例稱取藥材9份,根據(jù)正交試驗(yàn)表加入規(guī)定量的水進(jìn)行回流提取,濾過,合并濾液,放冷,定容至合適的體積,搖勻。進(jìn)樣檢測,記錄峰面積,計(jì)算芒果苷及芍藥苷的提取率,用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,篩選出最佳提取工藝。結(jié)果見表2、表3、表4。

      表2水提工藝直觀分析表中, A、B、C項(xiàng)下K1、K2、K3值代表各因素分別采用3個(gè)不同水平時(shí)指標(biāo)性成分提取率的總和,R值代表K1、K2、K3的極差,即最大數(shù)據(jù)與最小數(shù)據(jù)的差值,D為空白列,無因素作用,不進(jìn)行分析。以芒果苷為指標(biāo)時(shí),A加水量項(xiàng)下的K1值為加水量為8倍時(shí)芒果苷提取率的總和,即176.89=47.98+64.98+63.93,R值為K3與K1的差值,即40.92=217.81-176.89。R值的大小提示各因素對芒果苷和芍藥苷提取率的影響大小依次均為:提取次數(shù)(因素C)>加水量(因素A)>提取時(shí)間(因素B)。由表3、表4兩指標(biāo)性成分方差分析表可知,提取次數(shù)(因素C)對芒果苷和芍藥苷提取率的影響均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而加水倍量(A)和提取時(shí)間(B)的影響則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),結(jié)合表2中K值大小,因素A加水量選擇K3,因素B提取時(shí)間選擇K1, 因素C提取次數(shù)選擇K3,因此,最優(yōu)工藝確定為A3B1C3,即加12倍量水,提取3次,每次1 h,進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

      表2 水提工藝直觀分析表

      表3 芒果苷提取率方差分析表

      表4 芍藥苷提取率方差分析表

      2.3.1 驗(yàn)證試驗(yàn)

      按處方比例3份藥材,按最優(yōu)工藝A3B1C3進(jìn)行工藝穩(wěn)定性驗(yàn)證試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明干膏得率均值為36.31%,RSD為0.58%;芒果苷提取率均值為88.06%,RSD為0.23%;芍藥苷提取率均值為94.69%,RSD為1.66%??梢娫撎崛」に嚱嗪椭笜?biāo)性成分收率高,重復(fù)性好,可為大規(guī)模生產(chǎn)提供參考。

      2.4 濃縮工藝和干燥工藝的考察

      2.4.1 濃縮工藝考察

      按處方比例稱取藥材,按最優(yōu)工藝進(jìn)行提取。精密量取3份等體積水提液,分別在60、70、80 ℃條件下減壓濃縮至相對密度1.10~1.20,放冷后分別加水復(fù)溶至2 000 mL,攪拌均勻。剩余藥液作為空白。測定芒果苷和芍藥苷的含量,計(jì)算不同溫度濃縮后指標(biāo)性成分損失率。試驗(yàn)結(jié)果見表5。

      表5 水液濃縮溫度考察(n=3)

      三個(gè)溫度條件下進(jìn)行減壓濃縮,芒果苷的損失率在10%以上,均較高;芍藥苷幾乎沒有影響,但綜合考慮,在生產(chǎn)中需要注意控制濃縮溫度。

      2.4.2 干燥工藝的考察

      按優(yōu)選的提取工藝和濃縮工藝得到稠膏,稱取等重量稠膏10份,取9份分別于60、70、80 ℃條件下減壓干燥,得干浸膏,另一份為參比組,用于計(jì)算干燥前含量。干浸膏與參比組均加水復(fù)溶至等體積,攪拌均勻。測定芒果苷和芍藥苷的含量,計(jì)算不同溫度干燥后指標(biāo)性成分損失率。試驗(yàn)結(jié)果見表6。

      表6 干燥溫度考察(n=3)

      三個(gè)溫度條件下進(jìn)行減壓干燥,芒果苷的損失率均較高;60 ℃時(shí)芍藥苷的損失率在10%以下,故確定溫度在60 ℃。在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)盡可能降低濃縮液的干燥溫度。

      2.5 成型工藝研究

      2.5.1 藥輔比的確定

      根據(jù)水提工藝研究的結(jié)果,每個(gè)處方的出膏量約為26 g,按0歲兒童最小服用量計(jì)算,每日3次,每次需服藥約3 g,選擇藥輔比1∶1進(jìn)行制粒。

      2.5.2 輔料的篩選

      2.5.2.1 浸膏粉及輔料吸濕百分率的測定

      選取顆粒劑中常用的輔料糊精、乳糖、可溶性淀粉進(jìn)行吸濕率考察,為篩選輔料提供依據(jù),按藥輔比1∶1分別將浸膏粉與各輔料混勻,精密稱量約2 g,置于干燥至恒重的稱量瓶中,鋪平,置于相對濕度為75%的盛有 NaCl過飽和溶液的干燥器中,于25 ℃室溫下放置,按時(shí)稱量,計(jì)算吸濕百分率。結(jié)果見表7、圖3。

      實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明浸膏粉吸濕性較強(qiáng),放置72 h后,吸濕率接近17%。加入上述輔料后,吸濕性均得到了改善,糊精與可溶性淀粉的防潮性相近,略優(yōu)于糖粉,為進(jìn)一步篩選輔料提供了依據(jù)。

      圖3 浸膏粉及輔料吸濕百分率曲線

      表7 浸膏粉及輔料吸濕百分率(%)

      2.5.2.2 輔料種類考察

      分別稱取浸膏粉和各輔料,按藥輔比1∶1混合均勻,加入95%乙醇制軟材,過14目篩整粒,60 ℃以下干燥,觀察軟材性狀、顆粒外觀性狀及過篩難易程度,結(jié)果見表8。

      表8 輔料種類考察

      通過對三種輔料的考察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入糊精和乳糖后,均能較好的制粒成型,加入糊精后顆粒的成型率較高,而加入可溶性淀粉后,顆粒較為松散、細(xì)粉較多,不易成型,因此,選用藥用糊精作為制粒時(shí)的輔料。

      2.5.3 潤濕劑乙醇濃度的考察

      稱取適量浸膏粉與糊精,按藥輔比1∶1混合均勻,分別噴入不同濃度的乙醇制粒,綜合軟材性狀、制粒難易程度及顆粒的性狀、粘結(jié)情況等進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)顯示,噴入90%乙醇,少量醇的加入便可使浸膏粉結(jié)塊,提示乙醇濃度低,未考察85%乙醇。噴入95%乙醇,軟材松軟無結(jié)塊,可完全通過篩網(wǎng),三批所得顆粒成型較好。因此可以考慮在制粒時(shí)選擇95 %乙醇為潤濕劑。

      2.5.4 矯味研究

      處方中含有龍膽、關(guān)黃柏、夏枯草等苦味藥及動(dòng)物藥鱉甲,口感和氣味不佳,兒童服用順應(yīng)性差,計(jì)劃采用加入甜味劑和香精的方式進(jìn)行矯味,并對甜味劑種類、加入量以及香精的種類進(jìn)行篩選,從而改善顆粒劑的口感和氣味。

      采用經(jīng)典人群口嘗評價(jià)法對顆粒劑進(jìn)行口感評價(jià),參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-8],選擇12名健康志愿者為受試者,評價(jià)前溫水漱口,品嘗時(shí)在口中作漱口動(dòng)作,停留10 s后吐出,口感分為入口、10 s內(nèi)味道及口腔殘余后味,根據(jù)口感進(jìn)行打分,品嘗完一種溶液后漱口至無味道殘留,再品嘗下一種溶液。

      2.5.5 甜味劑種類考察

      阿司帕坦、甜蜜素、甜菊素、糖精鈉、紐甜等高甜度甜味劑可以改善中藥制劑的的苦味[9],稱取等量的浸膏粉,分別加入不同種類相同比例的甜味劑,加入200 mL熱水?dāng)嚢杈鶆?,?jīng)口嘗后記錄口感,結(jié)果見表9。

      表9 不同種類甜味劑口感評價(jià)結(jié)果

      2.5.6 顆粒組成的考察

      WHO規(guī)定阿司帕坦的日攝取量不超過40 mg/kg[10],以0歲兒童體重3.2 kg計(jì),阿司帕坦的添加量應(yīng)小于0.7%。經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)初步確定了4種不同的顆粒組成,加入0.5%的阿司帕坦,用20倍體積熱水溶解后,經(jīng)口嘗進(jìn)一步進(jìn)行口感評價(jià),規(guī)定組成為浸膏粉:糊精1∶1(編號1)的顆??喽燃墑e為10。結(jié)果見表10。

      表10 不同組成顆粒的口感評價(jià)結(jié)果

      經(jīng)口嘗評價(jià)得知,優(yōu)先順序?yàn)?>5>3>2,與苦度級別評分一致。浸膏粉味道極苦,加入β-CD后可以改善入口味道,后味仍苦,蔗糖含量高的顆粒整體口感最佳??紤]到為兒童用藥,應(yīng)在改善口感的同時(shí)盡可能減少蔗糖用量,因此顆粒組成為浸膏粉:糊精:蔗糖10∶3∶7,加入阿司帕坦0.5%。沖泡后氣味不佳,考慮加入香精,提高兒童服藥的順應(yīng)性。

      2.5.7 香精種類的考察

      稱取一定質(zhì)量的顆粒(浸膏粉:糊精:蔗糖10∶3∶7,阿司帕坦0.5%),添加顆粒重量0.2%的不同種類的香精,加入20倍體積的熱水溶解后,口嘗記錄氣味和口感,結(jié)果見表11。

      表11 香精種類的氣味和口感評價(jià)結(jié)果

      結(jié)果表明,甜橙香精氣味清香,可以較好地改善顆??诟?。結(jié)合矯味研究的口嘗結(jié)果,確定顆粒組成為50%浸膏粉、35%蔗糖、15%糊精,加入顆粒重量0.5%阿司帕坦和0.2%的甜橙香精制粒。

      2.6 顆粒臨界相對濕度的測定

      考察環(huán)境濕度對顆粒生產(chǎn)的影響,配制不同種類鹽和水的過飽和溶液,分別置于7個(gè)玻璃干燥器中,于室溫下放置24 h以保持一定的相對濕度。將稱量瓶干燥至恒重,精密稱定實(shí)驗(yàn)室自制的復(fù)幼顆粒裝入稱量瓶,打開瓶蓋,分別放入上述7種不同相對濕度的干燥器中,平行操作兩份,密閉,置于穩(wěn)定環(huán)境中(25 ℃)放置7 d,取出,蓋嚴(yán),精密稱重。

      記錄復(fù)幼顆粒吸濕前后的質(zhì)量變化并計(jì)算復(fù)幼顆粒吸濕率,結(jié)果見表12。繪制吸濕平衡曲線并求出臨界相對濕度(CRH),結(jié)果見圖4。

      表12 復(fù)幼顆粒不同相對濕度下的吸濕率(%)

      圖4 復(fù)幼顆粒臨界相對(CRH)濕度曲線

      結(jié)果表明,復(fù)幼顆粒的臨界相對濕度約為80%。因此,在進(jìn)行混合、制粒操作時(shí),周邊的環(huán)境濕度應(yīng)盡量控制在80%以下,以免濕度過高導(dǎo)致吸濕,影響制粒效果。

      3 討論

      性早熟的治療常選用促性腺激素釋放激素類似物(Gonadotropin-releasing hormone analogue,GnRHa)[11],但其價(jià)格昂貴,長期服用易產(chǎn)生不良反應(yīng)[12]。因此,對于臨床癥狀較輕微的患兒不宜采用過于積極的西藥治療[13]。

      研究表明,治療兒童性早熟的中藥用藥特點(diǎn)以清熱瀉火、滋陰涼血為主,兼以疏肝理氣、化痰散結(jié),使用頻率最高的前5味中藥為清熱瀉火藥知母、清熱涼血藥生地黃和牡丹皮、清熱燥濕藥黃柏和清虛熱藥柴胡[14]。知柏地黃丸(知母、熟地黃、黃柏、澤瀉、牡丹皮、茯苓、山茱萸、山藥)源于《景岳全書》,具有滋腎陰、清相火的作用[15],可以有效地抑制性早熟患兒發(fā)育[16-21]。復(fù)幼方在知柏地黃方的基礎(chǔ)上化裁而成,用于女童性早熟的治療。

      復(fù)幼方由鹽知母、生地黃、玄參、牡丹皮、關(guān)黃柏等11味中藥組成,按照全方水提的工藝,根據(jù)2015版《中國藥典》藥材含量檢測方法對指標(biāo)成分進(jìn)行選擇,生地黃中梓醇極性大、出峰時(shí)間短,在復(fù)方中難以檢測,毛蕊花糖苷及玄參、關(guān)黃柏等藥材中的指標(biāo)性成分在水提液中含量低,部分藥材在藥典中無規(guī)定含測成分。故選擇君藥鹽知母中的芒果苷、佐使藥牡丹皮中的芍藥苷、丹皮酚作為指標(biāo)性成分。

      原方合劑采用水提的工藝未對加水量、提取次數(shù)和提取時(shí)間進(jìn)行系統(tǒng)研究,為使提取工藝更加合理,采用正交實(shí)驗(yàn),以干膏得率和芒果苷、芍藥苷、丹皮酚含量為評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行工藝優(yōu)選,由于9個(gè)正交試驗(yàn)中丹皮酚提取率整體在20%左右,不符合要求,因此舍棄此成分作為指標(biāo)成分,故未進(jìn)行丹皮酚的結(jié)果分析。

      濃縮工藝研究和干燥工藝研究中,芒果苷損失率較大,可能由于長時(shí)間加熱,芒果苷分子發(fā)生結(jié)構(gòu)變化所致[22],提示在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)注意控制加熱溫度及加熱時(shí)間。成型工藝研究結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件,采取濕法制粒,對輔料和矯味劑種類、潤濕劑濃度、制粒難易程度、顆粒外觀等進(jìn)行了考察,確定制劑的最佳成型工藝。復(fù)幼顆粒作為兒童制劑,應(yīng)改善原處方苦味藥材所致口感不佳問題,應(yīng)注意矯味劑的日攝取用量應(yīng)符合藥用輔料相關(guān)要求,香精的加入不僅能改善口感,還能使制劑氣味易于接受。采用經(jīng)典人群口嘗評價(jià)法,可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要采用不同方法,使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加客觀[23]。最終確定復(fù)幼顆粒的制備工藝為,全方加12倍量水提取3次,每次1 h,合并提取液,過濾,濾液減壓濃縮成稠膏(相對密度1.10~1.20,60 ℃),稠膏60 ℃減壓干燥成干膏,干膏粉:蔗糖:糊精的比例為10∶7∶3,加入0.5%阿司帕坦、0.2%甜橙香精矯味,95%乙醇溶液為潤濕劑制粒,環(huán)境濕度控制在80%以下。此方法穩(wěn)定可行,為復(fù)幼顆粒的中試放大及生產(chǎn)條件控制提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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