邸金霖，單萬亭，趙嬌，鞠愛霞，李秋紅

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040 )

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)起源于肝細(xì)胞的惡性腫瘤，屬于原發(fā)性肝癌的一種常見病理類型，是嚴(yán)重威脅人生命健康的因素之一。它早期治療首選手術(shù)切除，但術(shù)后有復(fù)發(fā)的可能性，常需結(jié)合藥物治療，而晚期則無治愈性，且對(duì)目前所采用的化學(xué)治療易產(chǎn)生耐受性[1-2]，因而，尋找抗肝細(xì)胞癌療效顯著且不易產(chǎn)生耐受性的治療手段成為目前亟待解決的熱點(diǎn)問題。阿霉素(Poxovubivin,POX)屬于廣譜抗腫瘤類化療藥，對(duì)多種腫瘤有顯著療效，有效作用于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，但腫瘤多藥耐藥性(Multidrug resistance，MDR)影響了它作為一線抗腫瘤藥物的應(yīng)用。芹菜素是天然存在的黃酮類化合物，近年來被報(bào)道可從抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和糾正腫瘤細(xì)胞耐藥性等多方面產(chǎn)生抗腫瘤作用[3-4]。體內(nèi)研究表明，芹菜素對(duì)阿霉素所致心臟毒性具有拮抗作用[5]，芹菜素可以改變阿霉素體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過程[6]。綜上，推測(cè)芹菜素可能會(huì)增加阿霉素的抗腫瘤作用。本研究旨在探索芹菜素對(duì)阿霉素抗肝癌作用的影響，為深入研究芹菜素對(duì)阿霉素抗肝癌的藥動(dòng)及分子機(jī)制研究提供細(xì)胞基礎(chǔ)，進(jìn)而為臨床治療提供新思路及聯(lián)合應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

阿霉素(MB1087)，芹菜素(MB2186)購(gòu)于大連美輪生物科技有限公司，青霉素-鏈霉素混合液、胎牛血清、胰酶和1640培養(yǎng)基均購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司，MTT(sigma，M2128)，細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天，C1052)，Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(absin, abs50001)。

1.2 儀器

Tecan InfiniteTM200 Pro多功能酶標(biāo)儀(Tecan, 瑞士)，流式細(xì)胞儀(Merck，德國(guó))。

1.3 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)

在37 ℃飽和濕度的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HepG2肝癌細(xì)胞(購(gòu)于上海中橋新舟生物科技有限公司)，將1%青霉素、1%鏈霉素和10%胎牛血清加入HepG2肝癌細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1.4 觀察項(xiàng)目及方法

1.4.1 采用MTT檢測(cè)HepG2肝癌細(xì)胞增殖情況

于96孔培養(yǎng)板中接種200 μL、密度104 mL-1的HepG2肝癌細(xì)胞，并置于規(guī)定條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底，此時(shí)一部分孔加入不同濃度的的阿霉素(0、0.1、0.2、0.5、1、5 μg·mL-1)，另一部分加入芹菜素(0、5、10、20、40、80 μmol·L-1)繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，培養(yǎng)結(jié)束后，小心移除上清液，加入濃度為5 mg·mL-1MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心移除上清液，每孔加入150 μL的二甲基亞砜(DMSO)，恒溫?fù)u床振蕩10 min，使生成的結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)的吸光度值。

1.4.2 Annexin V-FITC/PI 雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平

將2 mL、密度5×105mL-1的HepG2肝癌細(xì)胞懸液接種于96孔板置于適宜條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直到細(xì)胞增殖鋪滿瓶底面積的7/10～4/5，此時(shí)將96孔板分為空白組、阿霉素組、阿霉素聯(lián)合芹菜素組，加入相應(yīng)的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后，用含有2%BSA的0.25%胰酶消化處理貼壁細(xì)胞。1×PBS洗滌樣品管細(xì)胞，并置于離心機(jī)中2 000 r/min離心 5～10 min收集懸浮及貼壁細(xì)胞，重復(fù)先前操作，吸除上清液洗滌細(xì)胞，重新加入300 μL的1×Binding Buffer于樣品管中使細(xì)胞懸浮，同時(shí)加入Annexin V-FITC5 μL混勻，室溫孵育15 min進(jìn)行Annexin V-FITC標(biāo)記，最后加5 μL PI于樣品管中5 min進(jìn)行染色后置流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4.3 肝癌細(xì)胞HepG2周期檢測(cè)

將2 mL的密度5×105mL-1的HepG2肝癌細(xì)胞懸液接種于96孔板置于適宜條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底面積的7/10～4/5，此時(shí)將96孔板分為三組即空白組、阿霉素組、阿霉素聯(lián)合芹菜素組，加入相應(yīng)的藥物，繼續(xù)再進(jìn)行培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后用0.25%胰酶消化處理的貼壁細(xì)胞，用1×PBS洗滌1 000 r/min離心沉淀樣品管中的懸浮細(xì)胞，吸除上清液洗滌細(xì)胞，重復(fù)先前操作后于樣品管中加入1 mL預(yù)冷70%乙醇，輕輕吹打混勻，4 ℃固定2 h，1 000 r/min離心3～5 min，沉淀細(xì)胞。向樣品管中加入0.5 mLPI混勻，避光孵育30 min，置于488 nm波長(zhǎng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)紅色熒光，與此同時(shí)記錄檢測(cè)光散射情況。采用Mod Fit軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均利用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 阿霉素抑制肝癌細(xì)胞增殖活性

阿霉素處理24和48 h后，阿霉素對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制率明顯增加，且隨著劑量的增加抑制作用逐漸增強(qiáng)，具有濃度和時(shí)間依賴性；阿霉素處理肝癌細(xì)胞72 h后，肝癌細(xì)胞增殖抑制率明顯增加，大部分肝癌細(xì)胞增殖活性被抑制，且隨著劑量的增加，增殖抑制率逐漸增加。結(jié)果提示對(duì)于肝癌細(xì)胞的增殖，阿霉素具有劑量和時(shí)間依賴性抑制作用，見表1。

表1 不同濃度阿霉素在不同時(shí)間對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制率

2.2 芹菜素抑制肝癌細(xì)胞增殖活性

如表2所示，芹菜素處理24、48和72 h后，芹菜素對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制率明顯增加，且隨著濃度和時(shí)間的增加抑制作用逐漸增強(qiáng)，結(jié)果表明芹菜素對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用具有濃度和時(shí)間依賴性。

表2 不同濃度芹菜素在不同時(shí)間對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制率

2.3 Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平

圖1結(jié)果所示，阿霉素、阿霉素聯(lián)合芹菜素處理24 h，與空白組比較，阿霉素組，聯(lián)合組肝癌細(xì)胞凋亡率明顯升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與阿霉素組比較，聯(lián)合組肝癌細(xì)胞凋亡率明顯增加，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；結(jié)果表明芹菜素與阿霉素聯(lián)用能夠明顯增加肝癌細(xì)胞的凋亡率，芹菜素能夠增強(qiáng)阿霉素對(duì)肝癌細(xì)胞的促凋亡作用。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝癌細(xì)胞周期變化影響

圖2的結(jié)果表明，與空白組比較，阿霉素組、阿霉素聯(lián)合芹菜素組中肝癌細(xì)胞G0/G1期、S期百分比明顯增加(P<0.05)，G2/M期百分比明顯降低(P<0.05)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與阿霉素組比較，阿霉素聯(lián)合芹菜素組中肝癌細(xì)胞G0/G1期百分比明顯增加(P<0.05)，G2/M期百分比明顯降低(P<0.05)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示阿霉素可引起肝癌細(xì)胞停滯在G0/G1期，芹菜素能夠增加肝癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期。

圖1 各組藥物對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞凋亡影響

圖2 各組藥物對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞周期變化

3 討論

MDR是腫瘤化療失敗的最主要原因，其機(jī)制是MDR基因、MDR相關(guān)蛋白基因P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)基因的過度表達(dá)及對(duì)凋亡的耐受等導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度低或藥物靶分子改變，使其對(duì)結(jié)構(gòu)和作用靶點(diǎn)不同的其他抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥性[7]，因此，目前國(guó)內(nèi)外主要研究熱點(diǎn)在于尋找高效、低毒的MDR逆轉(zhuǎn)劑。中藥及中藥單體治療惡性腫瘤疾病具有多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，是MDR逆轉(zhuǎn)劑的尋找的主要方向[8-9]。芹菜素，又稱芹黃素、洋芹素、芹菜配基，是天然存在的黃酮類化合物。諸多國(guó)內(nèi)外研究顯示，芹菜素具有低毒、無誘變性等特點(diǎn)的抗腫瘤活性，其作用的途徑主要有以下幾種：一是通過調(diào)控腫瘤相關(guān)基因進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞通路導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或抑制腫瘤侵襲，二是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯中斷腫瘤細(xì)胞增殖，三是通過抑制腫瘤血管形成阻斷營(yíng)養(yǎng)供給，四是通過放化療增敏提高與之聯(lián)合應(yīng)用藥物的療效[10]。DOX是蒽環(huán)類廣譜抗腫瘤抗生素，屬于周期非特異性藥物，對(duì)處于G0、G1、S、 G2、M期的細(xì)胞均有殺滅作用，但由于易產(chǎn)生耐藥性，多與其他抗癌藥聯(lián)合使用[11]。研究發(fā)現(xiàn)阿霉素是P-gp和多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance protein，MRP)的底物[12]，能產(chǎn)生腫瘤MDR，從而影響其使用療效。同時(shí)芹菜素體外研究結(jié)果顯示，其通過抑制ATP酶活性，使多藥耐藥相關(guān)蛋白1(MRP1/ABCC1)供應(yīng)減少外排轉(zhuǎn)運(yùn)化療藥物的能量供應(yīng)減少?gòu)亩黾恿思?xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的MDR[4]。因此，推測(cè)芹菜素可能會(huì)增強(qiáng)阿霉素的抗腫瘤效果。

本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞層面研究芹菜素對(duì)阿霉素抗肝癌細(xì)胞作用的影響。通過細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明阿霉素和芹菜素對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用均有時(shí)間和濃度依賴性。在細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，與阿霉素單獨(dú)使用相比芹菜素聯(lián)合阿霉素共同使用，肝癌細(xì)胞凋亡率明顯增加。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝癌細(xì)胞周期變化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿霉素可引起肝癌細(xì)胞停滯在G0/G1期，芹菜素能夠增加肝癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期。上述結(jié)果能夠客觀地反映芹菜素與阿霉素聯(lián)用明顯增加肝癌細(xì)胞凋亡率，具有協(xié)同增效作用。

綜上所述，阿霉素引起肝癌細(xì)胞停滯在G0/G1期，芹菜素增加肝癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期，進(jìn)而促進(jìn)阿霉素對(duì)肝癌細(xì)胞的促凋亡作用，兩藥聯(lián)用增強(qiáng)了抗腫瘤效果，與推測(cè)具有一致性。低毒、無誘變性的芹菜素不僅能夠增加阿霉素抗腫瘤作用，同時(shí)還對(duì)阿霉素所致心肌損傷具有保護(hù)作用[13]。該研究為芹菜素和阿霉素聯(lián)用抗癌提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。然而，芹菜素與阿霉素聯(lián)用是否會(huì)產(chǎn)生其它作用，芹菜素是否能抑制P-gp逆轉(zhuǎn)阿霉素多藥耐藥性，還有待更加深入的研究。