張麗萍，徐磊，宋瑞雯，王慎軍，陳穎

(天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617)

抑郁癥(Depression)發(fā)病機(jī)制與腦區(qū)神經(jīng)可塑性發(fā)生改變密切相關(guān)[1]，比如抑郁癥可以導(dǎo)致海馬神經(jīng)元萎縮、前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞密度減低等不同腦神經(jīng)可塑性改變[2-4]。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是一類具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元代謝和功能活動(dòng)、指導(dǎo)修復(fù)等功能的內(nèi)源性蛋白質(zhì)，其在神經(jīng)元損傷的情況下能夠促進(jìn)神經(jīng)元生存、生長(zhǎng)和分化，故神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在調(diào)節(jié)神經(jīng)可塑性中發(fā)揮著重要作用?？梢?，研究神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在抑郁癥腦損傷中的保護(hù)作用尤為必要。課題組前期研究證實(shí)，加味溫膽湯有顯著的抗抑郁作用，其作用機(jī)制可能與修復(fù)海馬及下丘腦的神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷有關(guān)[5-6]。本實(shí)驗(yàn)以孤養(yǎng)結(jié)合慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(Chronic unpredietable mild stress，CUMS)方法復(fù)制的抑郁模型大鼠為研究對(duì)象，考察加味溫膽湯對(duì)抑郁大鼠前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元及血清中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Glial cell-line derived neurotrophic factor，GDNF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)的影響，進(jìn)一步闡明加味溫膽湯抗抑郁作用機(jī)制是否與調(diào)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子修復(fù)抑郁模型大鼠腦損傷有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用SPF級(jí)8周齡健康雄性SD大鼠45只，體質(zhì)量180～200 g，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(軍)2017-0001。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，篩選出30只行為學(xué)評(píng)分相近的大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)編號(hào)，并分為正常對(duì)照組、模型組、加味溫膽湯組3個(gè)組別，每組10只。正常對(duì)照組每日正常進(jìn)水、進(jìn)食，模型組、加味溫膽湯組連續(xù)21 d采用孤養(yǎng)結(jié)合CUMS方法誘導(dǎo)抑郁大鼠模型。

中藥復(fù)方加味溫膽湯(由半夏10 g，厚樸10 g，竹茹6 g，枳實(shí)10 g，陳皮10 g，云茯苓30 g，桃仁10 g，郁金15 g，合歡花30 g，姜黃30 g，柏子仁30 g，石菖蒲20 g，遠(yuǎn)志6 g，炒麥芽30 g，生意苡仁30 g，大黃3 g組成)購(gòu)于北京同仁堂天津南開大藥房有限公司，選用優(yōu)質(zhì)藥材，經(jīng)中藥鑒定室鑒定后，水煎濃縮為1.5 g/mL，置于4 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.1.3 主要試劑和儀器

Elisa試劑盒(品牌sbjbio，批號(hào)：SBJ-M0173-96T)由天津梓帆東南科技有限公司提供；酶標(biāo)儀(德國(guó)Thermo 公司)，超薄切片機(jī)(徠卡UC-7)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 給藥處理

造模成功后，正常對(duì)照組每日照舊正常進(jìn)水、進(jìn)食，模型組生理鹽水2 mL/(kg·d)灌胃，每日早晨8：00開始，加味溫膽湯組灌胃加味溫膽湯12 g/(kg·d) (相當(dāng)于70 kg成人等效量)，連續(xù)給藥4周。在造模成功后的給藥期間，為防止模型大鼠抑郁狀態(tài)出現(xiàn)消退，間斷給予除正常對(duì)照組外其他各組CUMS來(lái)維持其抑郁狀態(tài)。

1.2.2 造模方法

除正常對(duì)照組外，其它各組大鼠均采用分籠飼養(yǎng)方法，1 只/籠，自分組之日起，模型組及加味溫膽湯組接受21 d 9種未預(yù)知應(yīng)激，分別為：24 h禁食，24 h禁水，4 ℃冷水游泳5 min，通宵照明，45 ℃烘箱熱烘5 min，懸尾1 min，高速水平振蕩3 min，夾尾1 min和100 V電擊足底1 min。21日內(nèi)每天隨機(jī)安排給予1種刺激，每種刺激約出現(xiàn)2～3次，且不能連續(xù)出現(xiàn)，使大鼠不能預(yù)知每天給予何種刺激。

1.2.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

當(dāng)前，我國(guó)人口老齡化問題較為嚴(yán)重。從需求的角度，2020年，全國(guó)60歲以上老年人口將增加到2.55億人，高齡老年人將增加到約為2900萬(wàn)人。此外，老人獨(dú)居的情況日益增加，目前，我國(guó)大中城市老年空巢家庭率已達(dá)到70%，到2020年，將增加到約1.18億人。

各組大鼠分別于造模前、造模后及給藥干預(yù)后進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)試。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)總分為大鼠水平活動(dòng)得分與垂直活動(dòng)得分之和。以大鼠穿越曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱底面1個(gè)方塊 (四爪均進(jìn)入方格方可計(jì)分) 或原地旋轉(zhuǎn)1周記為水平活動(dòng)得1分；大鼠兩前爪騰空或攀附墻壁視為直立次數(shù)，計(jì)為垂直活動(dòng)得分，每直立1次計(jì)1分。分別于造模前、造模21 d后及給藥28 d后測(cè)定各組大鼠水平活動(dòng)得分和垂直活動(dòng)得分，每只鼠每次觀察4 min， 去掉之前1 min適應(yīng)時(shí)間，讀取后3 min活動(dòng)數(shù)據(jù)，計(jì)算并比較各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分情況。

1.2.4 糖水偏好實(shí)驗(yàn)

各組大鼠在造模前、造模后及給藥干預(yù)后進(jìn)行糖水偏好實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前先進(jìn)行糖水適應(yīng)，第1天給予2瓶1%的蔗糖水，大鼠自由飲用；第2天給予1瓶1%的蔗糖水、1瓶純水24 h，12 h時(shí)交換2瓶的位置，大鼠自由飲用；然后禁食禁水24 h，隨后給予1瓶1%的蔗糖水、1瓶純水，2瓶位置隨機(jī)放置(2瓶水給前已稱重)，1 h后取出稱取剩余重量，觀察其在1 h內(nèi)的糖水和純水的消耗量，并排除飲水瓶滴漏所致的液體消耗量。糖水偏好實(shí)驗(yàn)得分=糖水消耗量/總液體消耗量×100%。

1.2.5 HE染色觀察前額葉皮質(zhì)形態(tài)變化

將固定于4%甲醛溶液中的前額葉皮質(zhì)包埋于石蠟中，在切片機(jī)上切片后置于載玻片上，使用蘇木精-伊紅染色，在顯微鏡下觀察前額葉皮質(zhì)形態(tài)變化，取前額葉皮質(zhì)部位拍片，然后將各組大鼠前額葉皮質(zhì)進(jìn)行對(duì)比，分析各組大鼠前額葉皮質(zhì)的病理?yè)p傷情況。

1.2.6 Elisa檢測(cè)血清細(xì)胞因子表達(dá)

從大鼠目?jī)?nèi)眥取血，收集到抗凝管中，室溫下血液自然凝固20～30 min后，2 000～3 000 r/min離心20 min左右，收集上清于1.5 mL離心管中，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱備用。嚴(yán)格按照Elisa試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，檢測(cè)各組大鼠血清中BDNF、TGF-β和GDNF的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 加味溫膽湯對(duì)抑郁模型大鼠行為學(xué)的影響

2.1.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分變化情況

造模前各組曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；造模21 d后，模型組、加味溫膽湯組曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明造模成功；給藥28 d后，與正常對(duì)照組相比，模型組曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與模型組相比，加味溫膽湯組曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 不同時(shí)間段各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分

2.1.2 糖水消耗量變化情況

造模前各組大鼠的活動(dòng)度和糖水偏愛差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模21 d后，模型組、加味溫膽湯組糖水偏愛率得分低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明造模成功；給藥28 d后，與正常對(duì)照組相比，模型組糖水偏好率低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，加味溫膽湯組糖水偏好率得分高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 不同時(shí)間段各組大鼠糖水偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 HE染色結(jié)果

空白對(duì)照組大鼠前額葉皮質(zhì)區(qū)域神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則，排列整齊有序，細(xì)胞間隙正常，結(jié)構(gòu)完整，染色均勻；而模型組大鼠前額葉皮質(zhì)區(qū)域神經(jīng)元胞體腫脹明顯，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞質(zhì)染色加深，腦區(qū)損傷情況較為嚴(yán)重；在給予加味溫膽湯干預(yù)后，模型大鼠前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元損傷明顯緩解，結(jié)構(gòu)基本正常，腦區(qū)損傷情況得到明顯緩解。見圖1。

圖1 各組大鼠前額葉皮質(zhì)HE染色結(jié)果

2.3 加味溫膽湯對(duì)抑郁模型大鼠血清神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組血清BDNF、GDNF和TGF-β濃度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，加味溫膽湯組血清BDNF、TGF-β和GDNF濃度上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清BDNF、GDNF和TGF-β濃度變化

3 討論

截止目前，抑郁癥病理生理機(jī)制尚未完全闡明，國(guó)內(nèi)外學(xué)者提出了神經(jīng)可塑性假說(shuō)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)假說(shuō)等多種假說(shuō)。其中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)假說(shuō)研究證實(shí)，與健康人相比，抑郁癥患者腦區(qū)和血清內(nèi)多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)水平發(fā)生了明顯改變，啟示神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可能成為抑郁癥的新型標(biāo)志物。目前已發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子包括BDNF、GDNF和TGF-β等，其在神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)可塑性中扮演著重要角色，因而備受學(xué)者關(guān)注。

BDNF是一類可促進(jìn)維持神經(jīng)元存活、生長(zhǎng)及功能的活性蛋白因子，其廣泛分布于海馬、前額葉皮質(zhì)等中樞神經(jīng)部位。BDNF通過(guò)與高親和受體酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase receptor B，TrkB)結(jié)合，發(fā)揮促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞的分化和存活、髓鞘形成、神經(jīng)元遷移和軸突伸縮，以及保護(hù)損傷后的神經(jīng)元等生物學(xué)作用[3]。研究表明，抑郁癥患者血清中BDNF表達(dá)水平低于正常人，且血清BDNF表達(dá)水平與抑郁嚴(yán)重程度可能呈負(fù)相關(guān)[7-8]；抑郁大鼠海馬及前額葉皮層的BDNF表達(dá)量顯著下降，且海馬區(qū)神經(jīng)元軸突減少[9-11]。

GDNF是由膠質(zhì)細(xì)胞衍生出的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，能夠促進(jìn)海馬神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)、海馬和皮層神經(jīng)元突觸的形成，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的存活、分化、增殖和遷移具有重要營(yíng)養(yǎng)作用[12-13]。此外，GDNF還參與學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程，對(duì)認(rèn)知功能具有一定的調(diào)節(jié)作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者GDNF水平下降，治療后恢復(fù)正常，且GDNF水平與抑郁得分呈負(fù)相關(guān)[15-16]。在動(dòng)物研究中也同樣發(fā)現(xiàn)，抑郁大鼠海馬GDNF表達(dá)量顯著下降，經(jīng)天麻素干預(yù)后GDNF水平得以恢復(fù)[17]。因此，GDNF可作為抑郁癥的外周標(biāo)志物，GDNF穩(wěn)態(tài)控制可能成為抗抑郁治療的新靶點(diǎn)。

TGF-β是一類新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，具有免疫功能，在記憶形成和突觸可塑性中起著關(guān)鍵作用。重度抑郁癥患者(Major depressive disorder,MDD)的TGF-β1血漿水平降低，且與抑郁癥嚴(yán)重程度相關(guān)，并顯著增加MDD患者的治療抵抗力[18]。

本實(shí)驗(yàn)研究同樣表明：抑郁模型大鼠前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元出現(xiàn)損傷，血清中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、GDNF和TGF-β濃度下降；而加味溫膽湯對(duì)抑郁模型大鼠干預(yù)后，能夠顯著改善抑郁模型大鼠的抑郁行為，明顯減輕其前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元損傷程度，并且血清中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、GDNF和TGF-β濃度明顯升高，證實(shí)了加味溫膽湯能夠通過(guò)提高抑郁動(dòng)物模型大鼠血清神經(jīng)保護(hù)因子水平，改善神經(jīng)元損傷，從而發(fā)揮抗抑郁作用。