響應曲面法優(yōu)化梔子苷保健果凍的研究

程鈺迪，程敏，2*，王銳，鄭國慶，梁旭華

（1.商洛學院生物醫(yī)藥與食品工程學院，陜西 商洛 726000；2.陜西秦嶺特色生物資源產(chǎn)業(yè)技術研究院有限公司，陜西 商洛 726000）

梔子（Gardenia jasminoides Ellis）屬茜草科梔子屬植物，又名黃梔子、山梔、白蟾，是我國應用廣泛的中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。梔子果是由新鮮成熟的梔子果實經(jīng)干燥處理后所得的產(chǎn)物，梔子果中富含藏紅花素類、環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類、有機脂肪酸類等多種化學成分，具有良好的抗氧化[1]、抗炎鎮(zhèn)痛[2-3]、抗微生物[4]、抗血栓[5]、消腫護肝[6]等功效。梔子中提取出的梔子色素作為天然色素，被廣泛應用于食品行業(yè)中[7]。1998年衛(wèi)生部公布梔子果為藥食兩用資源后，梔子在食品中的應用逐漸引起人們的重視。梔子苷是鑒別和評價梔子質量標準的依據(jù)，在保肝利膽[8]、抗抑郁[9]、解熱鎮(zhèn)痛和保護心血管內皮細胞等方面具有一定功效。目前國內外學者針對梔子的化學成分與藥理藥效方面研究較多，但將其作為保健食品以及在食品工業(yè)中的應用還不多見。

市面上常見的果凍，外觀晶瑩，色彩鮮亮，口感柔滑細膩，深受消費者的喜愛。但隨著人們對健康生活的關注，具有高營養(yǎng)價值和一定保健功能的果凍可能是未來的發(fā)展方向[10]。梁曉娟等[11-13]通過使用百合、柿子和芹菜以及其它藥食兩用食品，對果凍的營養(yǎng)保健功效進行了研究。目前尚無關于以梔子苷為主要成分的果凍的研究報道。本研究針對梔子苷的提取工藝和梔子苷保健果凍制備工藝進行雙優(yōu)化，旨在開發(fā)出一款色澤誘人、口感光滑細膩且具有一定清熱利膽功效的梔子苷保健果凍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梔子苷對照品（批號AF9032906，純度≥98%）：成都埃法生物科技有限公司；梔子果實：市售，產(chǎn)自河南洛陽；乙腈（色譜純）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；乙酸乙酯（分析純）：成都金山化學試劑有限公司；瓊脂粉、木糖醇：市售；試驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

LC-20A高效液相色譜儀：日本島津（中國）有限公司；S-114電子分析天平：上海梅穎浦儀器有限公司；800Y-304粉碎機：鉑歐五金制品有限公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海力辰邦西儀器科技有限公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵：長沙明杰儀器有限公司；RE-52旋轉蒸發(fā)儀：北京科偉永興儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點

1.3.2.1 梔子果實的預處理

梔子果實經(jīng)干燥粉碎后得到梔子粉末，過40目篩，備用。

1.3.2.2 梔子苷提取

取適量的梔子粉末與乙酸乙酯混合置于圓底燒瓶中，回流提取數(shù)小時后過濾，冷卻至10℃～30℃，得到梔子苷提取液[14]。

1.3.2.3 調配

以一定的料液比，將瓊脂粉加入水中，用小火煮膠，加熱使其完全溶解，過程中需不斷攪拌，再加入適量的木糖醇和梔子苷提取液，攪拌均勻。

1.3.2.4 罐裝殺菌

趁熱將混合好的果凍液倒進模具中，80℃～85℃條件下水浴加熱，持續(xù)15 min后冷卻至10℃～30℃，即得梔子苷保健果凍。

1.3.3 感官評價

由10名（5男5女）食品專業(yè)同學組成的評價小組，對試驗制備的果凍進行感官評價，主要從梔子苷保健果凍的外觀色澤、風味、口感和組織形態(tài)等多方面進行評價，具體的感官評定標準見表1[15]。

表1 感官評定標準Table 1 Sensory assessment standard

1.4 試驗設計

1.4.1 梔子苷提取工藝的單因素試驗

選取提取時間、提取溫度及梔子粉末與乙酸乙酯的料液比3個因素，進行單因素試驗，以梔子苷提取率為指標，確定適宜的單因素水平。

1.4.2 梔子苷提取工藝的響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選取提取時間、提取溫度、梔子粉末與乙酸乙酯的料液比3個因素進行響應面試驗，以梔子苷提取率作為評價指標，并采用Design-Expert 8.0.6軟件對二次多項方程進行顯著性分析，優(yōu)化梔子苷提取工藝參數(shù)。響應曲面的試驗因素和水平見表2。

表2 Box-Behnken試驗因素水平Table 2 Factors and levels used in Box-Behnken experimental design

1.4.3 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定梔子苷的含量

色譜條件[16]：色譜柱ShimadzuC18（250mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水體積比 15∶85；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：238 nm；進樣量：10 μL。

對照品溶液的制備：精密稱取2.03 mg梔子苷對照品于10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解定容，即得濃度為0.2 mg/mL的梔子苷對照品溶液。

樣品溶液的制備：取1 mL優(yōu)化后最佳工藝所得的梔子苷提取液于10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解定容，通過0.45 μm微孔濾膜后上機分析。

用50%甲醇將濃度為0.2 mg/mL的梔子苷對照品溶液逐級稀釋，得到濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL的溶液。在上述色譜條件下進行測定，得到一元線性回歸方程：Y=13 339X-10 393，R2=0.999 8，式中：Y為峰面積；X為梔子苷對照品濃度，μg/mL?；貧w方程顯示在20.00 μg/mL～160.00 μg/mL的濃度范圍內相關性良好。

1.4.4 果凍制備工藝的單因素試驗

選取瓊脂粉與水的料液比、梔子苷提取液添加量及木糖醇添加量3個因素，進行單因素試驗，以果凍感官評分為指標，確定適宜的因素水平。

1.4.5 果凍制備工藝的響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，選取瓊脂粉與水的料液比、梔子苷提取液添加量、木糖醇添加量3個因素為自變量，以感官評分為響應值，利用Box-Behnken試驗設計模型優(yōu)化果凍制備工藝條件。響應曲面試驗因素和水平見表3。

表3 Box-Behnken試驗因素水平Table 3 Factors and levels used in Box-Behnken experimental design

1.5 數(shù)據(jù)處理

在數(shù)據(jù)分析過程中，采用Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進行整理，利用Design-Expert 8.0.6軟件對響應面結果進行分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 梔子苷提取工藝的單因素試驗

單因素試驗結果見圖1。

圖1 提取時間、提取溫度、料液比對梔子苷提取率的影響Fig.1 Effects of extraction time，extraction temperature and material-liquid ratio on extraction rate of geniposide

由圖1可知，當提取時間小于3 h時，提取率不斷升高并在3 h達到最大值5.47%，當提取時間大于3 h時，可能由于梔子粉末中的雜質在長時間高溫回流下不斷被溶出，影響提取效果，提取率整體降低。因此，提取時間選擇3 h為宜。

提取溫度55℃～75℃時，提取率不斷增大，75℃時提取率最高達到4.65%，繼續(xù)升高溫度，提取率降低。可能由于梔子粉末與乙酸乙酯回流溫度過高，原料中的梔子苷被破壞，影響了提取效果。因此，提取溫度選擇75℃為宜。

料液比為 1∶2（g/mL）～1∶5（g/mL）時，梔子苷提取率隨溶劑體積增大不斷提高，1∶5（g/mL）時提取率最高達到4.91%，若繼續(xù)增加乙酸乙酯的體積，梔子苷提取率呈下降趨勢，可能是由于梔子粉末與乙酸乙酯的混合溶液含有其它雜質成分，溶劑體積升高使得雜質溶出，反而不利于梔子苷的提取。因此，料液比選擇1 ∶5（g/mL）為宜。

2.2 梔子苷提取工藝的響應面試驗結果

2.2.1 回歸模型的建立與檢驗

三因素三水平的響應面試驗結果見表4。

表4 Box-Behnken設計方案及結果Table 4 Experimental design and results for response surface analysis

續(xù)表4 Box-Behnken設計方案及結果Continue table 4 Experimental design and results for response surface analysis

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表4的試驗數(shù)據(jù)進行分析擬合，得到二次多項回歸方程為：Y=5.80+0.099A+0.15B+0.19C-0.085AB+0.12AC-0.20BC-0.63A2-0.54B2-0.35C2。

為了更好地驗證方程的有效性，對得出的梔子苷提取率的數(shù)學模型進行了方差分析，結果如表5所示。

表5 梔子苷提取率的方差分析Table 5 Analysis of variance of geniposide extraction rate

根據(jù)表5分析可知，模型的P<0.000 1極顯著[17]。模型的失擬項P>0.05，不顯著，表明擬合的回歸方程符合實際情況，該模型可行性高，誤差小，可用此模型對梔子苷的提取工藝參數(shù)進行分析和預測[18]。由顯著性檢驗分析得出，模型中 B、C 及 BC、A2、B2、C2均有極顯著的影響。一次項A對響應值有顯著影響。在所選取的水平因素范圍內，由F值的大小，可得出影響梔子苷提取率強弱的順序依次為C>B>A，即梔子粉末與乙酸乙酯料液比＞提取溫度＞提取時間。

該模型的R2=0.982 3，R2Adj=0.959 6，表明該模型與實際情況擬合度較好，模型可行性好，試驗誤差小[19]。變異系數(shù)CV=2.13%，說明模型預測效果好，能較好地反映真實試驗值，即梔子苷的最佳提取工藝可通過該方程來確定[20]。

2.2.2 響應面分析

響應面圖傾斜程度越大，表明響應值對因素的變化越敏感。反之，表明響應值對因素的變化不敏感，結果見圖2。

圖2 各因素的交互作用對梔子苷提取率的影響Fig.2 Effect of interaction of various factors on extraction rate of Geniposide

由響應面圖可知提取時間、提取溫度、料液比與梔子苷提取率存在相關性。采用Design-Expert 8.0.6軟件分析，獲得了梔子苷的最佳提取工藝為：提取時間3.10 h，提取溫度75.41℃，梔子粉末與乙酸乙酯的料液比1∶5.26（g/mL），預測梔子苷的提取率可達到5.84%。根據(jù)實際操作的可行性，最佳配方修正為：提取時間3.00 h，提取溫度75.00℃，梔子粉末與乙酸乙酯的料液比1∶5.00（g/mL），為檢驗模型預測的準確性，采用以上工藝，重復試驗3次，進行驗證試驗，此條件下測得的梔子苷提取率為5.81%，與預測值接近度為99.49%，表明該模型能很好地反映梔子苷的提取率與各影響因素之間的關系。

2.3 果凍制備工藝的單因素試驗

單因素試驗結果見圖3。

圖3 料液比、梔子苷提取液添加量、木糖醇添加量對果凍品質的影響Fig.3 Effects of material-liquid ratio，geniposide extract and xylitol on the quality of jelly

由圖3可見，感官評分隨溶劑體積增大先升高后降低，若瓊脂粉的添加量過少，果凍無法凝固、咀嚼口感不佳。當瓊脂粉與水的料液比達到1∶50（g/mL）時，果凍的硬度、彈性及咀嚼性達到最佳狀態(tài)。若瓊脂粉的添加量過高，果凍質地過硬、失去彈性。因此，下一步試驗中料液比選定為1∶50（g/mL）。

感官評分先隨梔子苷提取液添加量的增加而增大，呈明顯上升趨勢，梔子苷提取液添加量5%時，感官評分達到最大值，之后下降趨勢明顯。梔子苷提取液添加量過少，易導致梔子風味不明顯；添加過多，易導致產(chǎn)品口感過酸。因此，下一步試驗中梔子苷提取液添加量選定為5%。

當木糖醇的添加量低于8%時，口感略酸。當添加8%的木糖醇時，口感適宜，能凸顯梔子果凍的獨特風味。高于8%時，又過于甜膩。因此，下一步試驗中木糖醇添加量選定為8%。

2.4 果凍制備工藝的響應面試驗結果

2.4.1 回歸模型的建立與檢驗

選取瓊脂粉與水的料液比、梔子苷提取液添加量、木糖醇添加量為自變量，以感官評分為響應值，進行三因素三水平的試驗設計，對梔子苷保健果凍制備工藝參數(shù)進行優(yōu)化，結果見表6。

表6 Box-Behnken設計方案及結果Table 6 Experimental design and results for response surface analysis

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表6數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到二次多項回歸方程為：Y=89.40+4.50A+2.63B-4.88C-0.75AB+2.25AC-1.50BC-8.45A2-6.20B2-9.70C2。

梔子苷果凍制備工藝響應面優(yōu)化試驗方差分析結果如表7所示。

表7 梔子苷保健果凍感官研究結果的方差分析Table 7 Analysis of variance of sensory study results of geniposide health jelly

根據(jù)表7分析可知，模型的P<0.000 1，表明此模型極其顯著，失擬項P>0.05，表現(xiàn)為不顯著，因此模型成立，可用此模型對梔子苷果凍的制備工藝參數(shù)做出分析和預測。由顯著性檢驗分析得出，模型中一次項A、B、C 及二次項 A2、B2、C2對果凍感官評分有極顯著的影響。交互項AC有顯著影響。在所選取的水平因素范圍內，由F值的大小，可得出影響果凍感官評分強弱的順序依次為C>A>B，即木糖醇添加量＞料液比＞梔子苷提取液添加量。

模型的回歸系數(shù)為R2=0.989 4，校正回歸系數(shù)為R2Adj=0.975 7，表明該回歸模型擬合度較好，試驗誤差小，只有2.43%左右的變異不能用此模型進行分析。變異系數(shù)CV=1.88%，表示這個模型能反映各因素與果凍感官評分之間真實關系，即梔子苷保健果凍的最佳制備工藝可通過該方程來確定。

2.4.2 響應面圖分析

通過Design-Expert 8.0.6軟件繪制響應面分析圖，見圖4。

圖4 各因素的交互作用對果凍感官評分的影響Fig.4 Effects of interaction of various factors on sensory score of jelly

由響應面圖可知在優(yōu)化梔子苷保健果凍制備工藝配方的過程中，料液比、梔子苷提取液添加量、木糖醇添加量與感官評分存在相關性。采用Design-Expert 8.0.6軟件分析，獲得了梔子苷保健果凍的最佳制備工藝配方為：瓊脂粉與水的料液比 1∶52.24（g/mL），梔子苷提取液添加量5.23%，木糖醇添加量7.76%，預測梔子苷保健果凍的感官評分可達到90.79分。根據(jù)實際操作的可行性，最佳配方修正為：瓊脂粉與水的料液比 1∶52.00（g/mL），梔子苷提取液添加量 5.00%，木糖醇添加量8.00%，為檢驗模型預測的準確性，采用以上工藝配方，重復試驗3次，進行驗證試驗，此條件下制作的梔子苷保健果凍的感官評分為90.00分，與預測值接近度為99.13%，表明該模型能很好地反映梔子苷保健果凍的感官評分與各影響因素之間的關系。

3 結論

本研究采用響應面法，針對梔子苷的提取工藝和梔子苷保健果凍制備工藝進行雙優(yōu)化，得到梔子苷提取率3個影響因素的主次關系為：梔子粉末與乙酸乙酯的料液比＞提取溫度＞提取時間，梔子苷最佳提取工藝的條件為：提取時間3.00 h，提取溫度75.00℃，梔子粉末與乙酸乙酯的料液比1∶5.00（g/mL），該工藝條件下，梔子苷提取率可達到5.81%。得出梔子苷保健果凍的最佳制備工藝條件為：瓊脂粉與水的料液比1∶52.00（g/mL），梔子苷提取液添加量 5.00%，木糖醇添加量8.00%，該條件下梔子苷保健果凍的感官評分可達到90.00分。