楊坤，吳凱儀，張建煬，顧陽，劉桂瓊，管春成

(黔東南州食品藥品檢驗檢測中心，貴州 凱里 556012)

魚醬酸調(diào)味料是貴州省黔東南州苗族地區(qū)原生態(tài)飲食的一種傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味料食品，是以雷公山區(qū)域內(nèi)溪流中魚扇子、爬巖魚等河魚和當?shù)胤N植的鮮辣椒為主要原料，配以食鹽、生姜、白酒、醪糟、大米等輔料，采用傳統(tǒng)密閉發(fā)酵工藝釀制而成的一種新型半固態(tài)調(diào)味料[1-3]，其不僅富含大量人體必需的氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，而且具有提高食欲、健胃作用。氨基酸作為魚醬酸的重要營養(yǎng)指標之一，其組成和含量能夠在一定程度上反映魚醬酸的原材料來源和發(fā)酵程度，目前很少有研究報道魚醬酸調(diào)味料中氨基酸含量成分。因此，氨基酸含量成分的檢測對魚醬酸調(diào)味料的營養(yǎng)價值研究和質(zhì)量控制具有十分重要的意義。

目前，氨基酸的分析方法包括柱后衍生-高效液相色譜法[4-9]、離子交換色譜法[10-11]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等[12-15]。其中以柱后衍生-高效液相色譜法技術(shù)研制的氨基酸分析儀已被廣泛應用于氨基酸分析，但其具有耗時長、檢出限高等缺點，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因具有高靈敏度、高效快速和高通量等優(yōu)點而成為最近幾年國內(nèi)外分析氨基酸含量的熱點[16-18]。本研究基于UPLC-MS/MS技術(shù)，建立同時快速測定魚醬酸調(diào)味料中17種氨基酸的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

17種氨基酸混合標準溶液(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、亮氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、纈氨酸含量均為1.00 μmol/mL)：壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

甲醇(色譜純)：德國Merck公司；甲酸(色譜純)、鹽酸(優(yōu)級純)：國藥集團化學試劑有限公司；水為實驗室自制超純水；魚醬酸樣品：購于當?shù)爻小?/p>

1.1.2 儀器

AB SCIEX API 4000+質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng) 美國AB SCIEX公司；Agilent 1290 Infinity II型液相色譜儀 美國Agilent公司；Milli-Q純水機 美國Millipore公司；ML104電子天平 瑞士梅特勒-托利多(上海)儀器公司；3-18k型高速冷凍離心機 德國Sigma公司； KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器公司。

1.2 標準系列工作溶液的配制

準確吸取1.00 μmol/mL氨基酸混合標準溶液1.00 mL于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成濃度為100 nmol/mL的儲備液溶液，保存于4 ℃冰箱中，備用。

分別精密吸取不同體積的氨基酸儲備溶液，用水稀釋成不同濃度系列的混合標準溶液(質(zhì)量濃度見表2)，然后進液相色譜-質(zhì)譜儀分析測定，繪制峰面積與標準溶液濃度標準曲線。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理方法

水解氨基酸：稱取1.00 g樣品于50 mL離心管中，加30 mL水超聲40 min溶解，冷卻至室溫后定容至刻度，在6000 r/min下離心10 min，然后取適當溶液于25 mL容量瓶中加水定容至刻度，過0.22 μm水相濾膜，取續(xù)濾液上機。

酸水解氨基酸：稱取1.00 g樣品于20 mL水解管中，加入10 mL 6 mol/L鹽酸，充氮氣后蓋緊旋蓋，于110 ℃下酸解22 h后取出冷卻至室溫。轉(zhuǎn)移水解液至50 mL離心管中并用水多次沖洗水解管，用水定容至刻度，振蕩混勻，在6000 r/min下離心10 min，然后取適當溶液于25 mL容量瓶中加水定容至刻度，過0.22 μm水相濾膜，取續(xù)濾液上機。

1.3.2 分析條件

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，流動相A為水溶液(含0.1%甲酸)，B為乙腈(含0.1%甲酸)。梯度洗脫程序：0～1.50 min，1.0% B；1.50～2.00 min，20% B；2.00～3.00 min，80% B，3.00～4.90 min，80% B，4.90～5.00 min，1.0% B。后運行2.50 min，流速0.2 mL/min；進樣量2 μL；柱溫：30 ℃。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子電離模式，去溶劑溫度：500 ℃；氣簾氣壓力：172 kPa；碰撞氣壓力：41 kPa；離子氣1壓力：414 kPa；離子氣2壓力：379 kPa；離子噴射電壓：5500 V；掃描方式：多反應監(jiān)測(MRM)模式，其他質(zhì)譜參數(shù)條件見表1。

表1 氨基酸的質(zhì)譜分析參數(shù)

1.3.3 計算公式

采用標準曲線法計算氨基酸含量：

式中：X為式樣中氨基酸的含量，%；c為待測樣品各氨基酸的含量，nmol/mL；F為試樣稀釋倍數(shù)；V為試樣定容體積，mL；M為氨基酸分子質(zhì)量；m為試樣質(zhì)量，g；109為樣品含量換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

由于氨基酸分子含有氨基和羧基兩種官能團，其極性較大，本研究首先選擇了Waters ACQUITY UPLC BEH Hilic(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)和Waters ACQUITY UPLC BEH Amide(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)兩根親水色譜柱考察其保留效果，研究發(fā)現(xiàn)部分氨基酸出現(xiàn)拖尾和分叉現(xiàn)象，原因可能是樣品溶液用水溶解導致在Hilic親水色譜模式下出現(xiàn)溶劑擴散效應。而大部分氨基酸在普通C18色譜柱上保留效果較差，樣品中大量的強極性干擾物質(zhì)會干擾目標化合物，導致一定的基質(zhì)效應。因此，本研究選擇對親水有較大保留效果的T3色譜柱(Waters ACQUITY UPLC HSS T3，100 mm×2.1 mm，1.7 μm)進行分離，達到了較好的分離效果，其正離子多反應監(jiān)測色譜圖見圖1。

圖1 17種氨基酸的MRM色譜圖

進一步對流動性的種類進行考察，當選擇乙腈作為有機相時，亮氨酸和異亮氨酸無法實現(xiàn)基線分離，甲醇為流動相時，亮氨酸和異亮氨酸能達到較好的分離，并且保留效果增強。選擇甲酸銨和乙酸銨作為水相時，部分氨基酸出現(xiàn)信號抑制現(xiàn)象。因此，選擇0.1%甲酸水溶液作為水相能確保17種氨基酸的靈敏度。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在離子源正離子模式下以流動注射方式對17種氨基酸進行母離子(Q1)全掃描，確定各目標化合物的母離子，再對母離子進行二級質(zhì)譜掃描(MS2)，對錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化，每個化合物選擇2對響應值高的特征離子對作為定量及定性離子，丙氨酸和脯氨酸沒有找到合適的第2對特征離子，優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.3 方法學評價

在優(yōu)化的UPLC-MS/MS分析條件下，17種氨基酸在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與對應的峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9982～0.9999，以定量離子3倍信噪比(S/N=3)得到檢出限(LOD)，以定量離子10倍信噪比(S/N=10)得到定量下限(LOQ)，17種氨基酸的標準曲線和相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 17種氨基酸的線性方程、檢出限和定量限

2.4 游離氨基酸和酸化后氨基酸的含量

按照1.3.1對7批次魚醬酸樣品進行處理，17種氨基酸水解總含量為0.520%～3.335%，其中胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸和組氨酸含量低于0.03%，丙氨酸和亮氨酸含量高于0.15%。17種氨基酸酸水解總含量為1.807%～3.889%，其中氨酸、胱氨酸、酪氨酸和蘇氨酸含量低于0.10%，其中一批次魚醬酸調(diào)味料的水解和酸水解的17種氨基酸含量成分變化見圖2。

圖2 魚醬酸調(diào)味料中水解和酸水解的氨基酸含量

由圖2可知，酸水解后的魚醬酸中魚肉蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變氨基酸，其中和甘氨酸、纈氨酸和脯氨酸變化最大。

2.5 魚醬酸中各類氨基酸的含量分布

同時，對7批次魚醬酸調(diào)味料中17種氨基酸進行含量分析，結(jié)果見圖3。

圖3 魚醬酸調(diào)味料中各氨基酸含量

由圖3可知，7批次魚醬酸調(diào)味料中亮氨酸的含量較高，質(zhì)量分數(shù)為0.338%～1.219%，甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、谷氨酸、精氨酸、酪氨酸、蘇氨酸和纈氨酸的含量處于同一水平，質(zhì)量分數(shù)為0.008%～0.690%，絲氨酸、甲硫氨酸、組氨酸含量處于同一水平，質(zhì)量分數(shù)為0.004%～0.203%，胱氨酸含量最低，低于0.006%。

3 結(jié)論

本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定魚醬酸調(diào)味料中17種氨基酸含量，使用兩種不同的樣品前處理方式對魚醬酸調(diào)味料中氨基酸進行分析，確定了魚醬酸調(diào)味料中17種氨基酸的含量。本方法極大縮短了分析時間，在分析復雜樣品時可以獲得較高的選擇性和靈敏度，適用于食品中快速測定氨基酸的定性和定量分析。