枳術(shù)湯治療脾虛型便秘小鼠有效性實驗研究

門喚釗，劉 斌

（1.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110847；2.沈陽市肛腸醫(yī)院，遼寧 沈陽 110002）

慢傳輸型便秘（STC）又稱頑固性便秘，是功能性便秘（FC）最常見的類型。臨床上，STC患者有排便時間延長、便質(zhì)干硬、排便次數(shù)減少、排便不暢等癥狀。脾虛型便秘在臨床的表現(xiàn)上，與STC相似。長期便秘，會加重患者的焦慮情緒，形成肛裂、肛乳頭增生、肛門狹窄等肛門疾病，同時也會誘發(fā)心腦血管疾病，加重患者基礎(chǔ)疾病[1-2]。西醫(yī)治療便秘通常使用促胃動力藥、瀉藥，這些藥物可以短暫地緩解便秘的癥狀，長期使用會導致腸道內(nèi)發(fā)生病變。中醫(yī)通常采用湯劑、埋線、針灸、拔罐等方法進行治療，其副作用小且療效持久，因此目前臨床上通常采用中醫(yī)藥治療慢性便秘。枳術(shù)湯是治療脾虛型便秘的經(jīng)典方，現(xiàn)代藥理學表明，枳實中含的黃酮類成分以及白術(shù)中的石油醚組分和粗糖組分，可以有效地改善脾虛型便秘的癥狀[3-5]。因此，本實驗選用枳術(shù)湯治療脾虛型便秘，為枳術(shù)湯治療脾虛型便秘提供實驗理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級小鼠40 只，雌雄各半，(20±2)g，所有小鼠均由遼寧省實驗動物質(zhì)量檢測中心進行質(zhì)量檢測。

1.1.2 實驗藥品及主要試劑：番瀉葉500 g購于沈陽維康金天醫(yī)藥有限公司塔灣店；白術(shù)60 g和枳實30 g，均購于遼寧中醫(yī)藥大學旁成大方圓藥房；麻仁軟膠囊購于海王星辰健康藥房（柴河街店）。AnticAMP蛋白Kinase Catalytic subunit抗體購于Abcam公司，Anti-PKA beta（catalytic subunit）抗體購于Abcam公司。

1.1.3 實驗主要器材：電熱恒溫鼓風干燥箱、電子秤、顯微鏡、鑷子、眼科剪均由遼寧中醫(yī)藥大學實驗中心提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模及治療的方法：將40 只SPF小鼠隨機分為空白對照組、模型組、枳術(shù)湯組、麻仁軟膠囊組，每組10 只雌雄各半，經(jīng)7 d適應(yīng)性喂養(yǎng)后，對除空白對照組以外的組別，按照鄒穎等[6]的方法進行脾虛型便秘模型復制，造模成功后對各組小鼠的糞便含水率進行測量，并給予各組小鼠相應(yīng)的藥物進行治療。其中，枳術(shù)湯組給予臨床等劑量的枳術(shù)湯進行治療（即枳術(shù)湯在臨床上治療脾虛型便秘患者的每日用量為白術(shù)30 g、枳實15 g，共45 g，經(jīng)換算枳術(shù)湯組小鼠的用藥量為：45×9.1×25/60 000＝0.17 g，0.17/0.025＝6.8 g·kg-1·d-1）；麻仁軟膠囊組給予0.17 g·kg-1·d-1的麻仁軟膠囊懸浮液進行治療；空白對照組及模型組則灌胃等體積的蒸餾水。經(jīng)過7 d治療后，檢測各組小鼠的糞便含水率，并截取小鼠部分結(jié)腸，采用免疫組化的方法檢測小鼠結(jié)腸中cAMP、PKA蛋白含量的變化。

1.2.2 糞便含水率的檢測方法：對各組小鼠糞便含水率進行兩次測量，均在早上8:00開始撿取糞便，測出各組小鼠糞便濕重，并按組別放入電熱恒溫干燥箱內(nèi)進行干燥，然后測出糞便的干重。依據(jù)公式：含水率（%）＝(糞便濕重－糞便干重)/糞便濕重×100%[7]，計算出相應(yīng)組別的糞便含水率，進行統(tǒng)計分析。

1.2.3 免疫組化的方法：將實驗各組小鼠部分結(jié)腸取出，將結(jié)腸組織進行脫水，石蠟包埋后，進行切片，將結(jié)腸組織貼附于載玻片上，烤片機上進行烘烤，隨后二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，PBS緩沖液清洗，用檸檬酸鹽緩沖液和過氧化氫溶液對抗原進行修復并消除內(nèi)源性過氧化物酶，并用山羊血清進行封閉。并用一抗、二抗在相應(yīng)的溫度下進行孵育，經(jīng)過顯色、復染、封片后，鏡下觀察，測定5個隨機視野的平均光密度值，并以平均值為該樣本中目的蛋白相對表達水平，進行統(tǒng)計分析。

1.2.4 統(tǒng)計方法：本實驗所得的所有數(shù)據(jù)均運用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠治療前后糞便含水率的變化 治療前模型組、枳術(shù)湯組、麻仁軟膠囊組小鼠的糞便含水率均低于空白對照組小鼠的糞便含水率（P＜0.01），枳術(shù)湯組、麻仁軟膠囊組的糞便含水率與模型組小鼠的糞便含水率相似（P＞0.05）。經(jīng)7 d的藥物治療，與空白對照組相比，模型組、枳術(shù)湯組、麻仁軟膠囊組均有顯著變化（P＜0.01）；枳術(shù)湯組及麻仁軟膠囊組小鼠的糞便含水率均顯著高于模型組小鼠的糞便含水率（P＜0.01），其中枳術(shù)湯組小鼠的糞便含水率明顯高于麻仁軟膠囊組小鼠的糞便含水率（P＜0.01）。經(jīng)過7 d治療，枳術(shù)湯組小鼠的糞便含水率與治療前相比有顯著增長，麻仁軟膠囊組小鼠的糞便含水率與治療前相比也有小幅度增長，模型組及空白對照組與治療前相比小鼠的糞便含 水率變化不大。具體情況如表1、圖1所示。

表1 治療前后各組小鼠糞便含水率的變化（±s）

表1 治療前后各組小鼠糞便含水率的變化（±s）

注：與空白對照組相比，★P＜0.01；與模型組相比，△P＜0.01。

組別 n 治療前小鼠糞便含水率（%） 治療后小鼠糞便含水率（%）空白對照組 10 30.93±1.43 30.98±1.51模型組 10 12.57±1.34★ 12.32±1.44★△枳術(shù)湯組 10 13.29±0.06★ 17.71±0.99★△麻仁軟膠囊組 10 13.55±1.44★ 14.75±0.78★△

圖1 治療前后各組小鼠糞便含水率柱形圖

2.2 免疫組化的結(jié)果

2.2.1 治療后各組小鼠結(jié)腸中cAMP的蛋白表達：經(jīng)過7 d藥物治療后，與空白對照組相比，模型組、麻仁軟膠囊組、枳術(shù)湯組差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組相比，麻仁軟膠囊組及枳術(shù)湯組小鼠結(jié)腸中cAMP的含量均有顯著增長（P＜0.01）。枳術(shù)湯組小鼠結(jié)腸中的cAMP平均OD值，高于麻仁軟膠囊組小鼠結(jié)腸中cAMP平均OD值，但兩者差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具體情況如表2、圖2所示。各組經(jīng)免疫組化染色cAMP表達如圖3所示。

表2 各組小鼠結(jié)腸cAMP陽性表達比較（±s）

表2 各組小鼠結(jié)腸cAMP陽性表達比較（±s）

注：與空白對照組相比，★P＜0.01；與模型組相比，△P＜0.01。

組別 n cAMP空白對照組 10 0.34±0.03模型組 10 0.096±0.01★麻仁軟膠囊組 10 0.23±0.01★△枳術(shù)湯組 10 0.25±0.02★△

圖2 各組小鼠結(jié)腸cAMP表達水平柱形圖

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織中cAMP表達免疫組化照片

2.2.2 治療后各組小鼠結(jié)腸中PKA的蛋白表達：經(jīng)過7 d藥物治療后，與空白對照組相比，模型組、麻仁軟膠囊組、枳術(shù)湯組差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組相比，麻仁軟膠囊組及枳術(shù)湯組小鼠結(jié)腸中PKA的含量均有顯著增長（P＜0.01）。枳術(shù)湯組小鼠結(jié)腸中的PKA平均OD值，高于麻仁軟膠囊組小鼠結(jié)腸中PKA平均OD值，但兩者差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具體情況如表3、圖4所示。各組經(jīng)免疫組化染色PKA的表達免 疫組織化學照片如圖5所示。

表3 各組小鼠結(jié)腸PKA陽性表達比較（±s）

表3 各組小鼠結(jié)腸PKA陽性表達比較（±s）

注：與空白對照組相比，★P＜0.01；與模型組相比，△P＜0.01。

組別 n PKA空白對照組 10 0.35±0.02模型組 10 0.096±0.01★麻仁軟膠囊組 10 0.23±0.02★△枳術(shù)湯組 10 0.24±0.01★△

圖4 各組小鼠結(jié)腸組織中PKA表達柱形圖

圖5 各組小鼠結(jié)腸組織中PKA表達免疫組化照片

3 討論

便秘是臨床上較為常見的一種慢性疾病，而便秘的形成與脾胃的關(guān)系十分密切，脾胃氣滯、濕邪困脾、胃熱腸燥、脾虛血虧等均可導致便秘的發(fā)生[8]。中醫(yī)脾虛型便秘與臨床上STC癥狀相似，且脾虛型便秘小鼠模型造模方便，存活率高[9]。

枳術(shù)湯在臨床上治療脾虛型便秘有非常好的效果，全方由枳實和白術(shù)兩藥組成，二藥配伍相輔相成有“健脾運脾，行氣導滯通便”之功，是治療便秘的經(jīng)典名方，目前在臨床上被廣泛應(yīng)用。但是其相關(guān)的實驗機理較少，因此本實驗選用枳術(shù)湯治療治療脾虛型便秘小鼠模型，為枳術(shù)湯治療脾虛型便秘提供一定的實驗理論依據(jù)。

cAMP-PKA信號通路是參與物質(zhì)能量代謝的重要細胞傳導通路，環(huán)腺苷酸（cyclic adenylic acid cAMP）將細胞外的刺激信號，通過細胞內(nèi)cAMP濃度的變化來影響機體中細胞內(nèi)信號的轉(zhuǎn)導途徑，從而調(diào)節(jié)蛋白活性、細胞功能和基因表達，影響細胞內(nèi)各種生理活動[10]。而cAMP的調(diào)節(jié)作用，需要依靠激活PKA實現(xiàn)。被激活的PKA通過各種細胞內(nèi)蛋白的磷酸化與cAMP反應(yīng)元件結(jié)合，對機體細胞的基因表達進行調(diào)節(jié)[11]。本實驗的結(jié)果顯示，脾虛型便秘小鼠的糞便含水率與正常小鼠的糞便含水率相差明顯，且結(jié)腸中cAMP、PKA的蛋白表達水平均有所下降，在經(jīng)過7 d的藥物治療后枳術(shù)湯組的小鼠的糞便含水率增長明顯，且小鼠結(jié)腸中cAMP、PKA的蛋白表達水平有明顯的增長。說明枳術(shù)湯可能是通過上調(diào)結(jié)腸cAMP-PKA信號通路的含量來增加小鼠糞便含水率，加快腸內(nèi)蠕動，使糞便排出體外，從而改善便秘的癥狀。

綜上，本實驗通過比較枳術(shù)湯治療前后各組糞便含水率的變化，以及各組小鼠結(jié)腸中cAMP、PKA蛋白表達含量的變化，驗證了枳術(shù)湯能有效治療脾虛型便秘。