中性粒細胞型哮喘差異表達基因的生物信息學(xué)分析及其潛在治療藥物篩選

宋偉華，謝欣辛，秦 瓊，范國榮

(1. 上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，上海 200080;2. 上海市皮膚病醫(yī)院藥劑科，上海 200443;3. 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 蘇州 215006)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種以氣道高反應(yīng)性為特征的由多種炎癥細胞參與的慢性氣道炎癥性疾病。哮喘具有明顯的異質(zhì)性，根據(jù)患者肺部及氣道組織中不同類型的炎癥細胞，哮喘可分為嗜酸粒細胞型(eosinophilic asthma，EA)、中性粒細胞型(neutrophilic asthma，NA)和混合粒細胞型(mixed granulocytic asthma，MA)[1]。有研究顯示[2]，NA對激素的治療反應(yīng)性差，臨床癥狀比其它類型的哮喘更難控制，但其具體機制尚未完全明確。因此，深入探討NA的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點及干預(yù)藥物具有重要的臨床意義。

隨著基因芯片技術(shù)與高通量技術(shù)的發(fā)展，運用生物信息學(xué)方法對基因芯片數(shù)據(jù)進行挖掘可以快速有效地篩選出差異基因，近年來，廣泛應(yīng)用于疾病的致病機制的闡明、藥物治療靶點的篩選[3-5]。本研究從GEO數(shù)據(jù)庫中篩選出NA的相關(guān)差異基因，進而對這些基因進行GO功能富集和KEGG信號通路富集分析，并從PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出關(guān)鍵基因，采用分子對接技術(shù)篩選潛在的先導(dǎo)化合物，為進一步闡明NA的發(fā)病機制和尋找新的治療藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 差異基因的篩選基因表達數(shù)據(jù)來自GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE137268芯片，利用GEO2R在線分析工具對基因表達譜進行分析，篩選出滿足|log(2 Fold Change)|≥1.0且P<0.05的差異表達基因，同時至少一個樣品該基因FPKM≥1(去除表達量低的基因)。其中l(wèi)og 2FC正值為上調(diào)基因，log 2FC負值為下調(diào)基因。

1.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵基因篩選將獲得的差異基因上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，物種設(shè)定為人類，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，下載TSV文件，利用 Cytoscape 軟件進行PPI網(wǎng)絡(luò)可視化，對構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)進行分析，將節(jié)點中心度值(Degree)排在前10位的基因靶點作為關(guān)鍵靶點。

1.3 差異基因的GO功能與KEGG信號通路富集分析利用DAVID數(shù)據(jù)庫對差異基因進行GO(Gene ontology，GO)基因功能注釋分析，包括生物學(xué)過程(Biological process，BP)、分子功能(Molecular function，MF)和細胞組分(Cellular component， CC); 并對差異基因進行KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG) 通路富集分析。選取前10個條目進行分析，以P<0.05作為顯著性基因富集篩選標準。

1.4 分子對接技術(shù)篩選先導(dǎo)化合物采用ChemSketch軟件畫出對接化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，將其3D結(jié)構(gòu)能量最小化后保存為MOL格式。將目標基因上傳至PDB數(shù)據(jù)庫，將基因的3D結(jié)構(gòu)保存為PDB格式，用iGEMDOCK分子對接軟件進行對接，根據(jù)對接能量的高低來判斷靶蛋白與化合物的結(jié)合程度，能量越低，代表二者的結(jié)合程度越高。

2 結(jié)果

2.1 NA與健康人群中差異表達基因的篩選從GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE137268芯片獲得了11個NA和15個健康人的誘導(dǎo)痰基因表達數(shù)據(jù)，通過GEO2R對兩組數(shù)據(jù)進行分析，篩選出滿足|log2FC|≥1.0且P<0.05的差異表達基因，共篩選出147個差異基因，其中上調(diào)基因7個，下調(diào)基因140個，見Tab 1。

Tab 1 The differential expression genes of NA patients compared with healthy people

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)分析及關(guān)鍵基因篩選通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，通過Cytoscape軟件將綜合得分大于0.4的相互作用的PPI網(wǎng)絡(luò)可視化。如Fig 1所示，該網(wǎng)絡(luò)由99節(jié)點和326邊構(gòu)成，節(jié)點代表基因靶點，邊代表相互作用。使用Cytoscape 軟件中的“NetworkAnalyzer”插件對該網(wǎng)絡(luò)進行分析，根據(jù)Degree值排序，排名前10的關(guān)鍵基因分別為CXCL8、FPR2、CXCL1、TNFRSF1B、CXCR1、FPR1、CXCR4、CLEC4D、GPR84與CXCR2。

Fig 1 PPI network of differential expression genes

2.3 GO注釋與KEEG通路富集分析通過DAVID數(shù)據(jù)庫對147個差異基因進行GO與KEGG通路富集分析，結(jié)果見Fig 2與Tab 2。GO富集顯示這些基因主要參與炎癥反應(yīng)、趨化作用、免疫反應(yīng)等生物過程；在細胞組分中主要影響細胞膜、細胞外泌體、膜錨蛋白等；在分子功能中主要影響受體活性、碳水化合物結(jié)合與IL-8受體活性等。KEGG通路富集分析顯示，差異表達基因與細胞因子-細胞因子受體相互作用、環(huán)磷酸腺苷信號通路、NOD樣受體、補體與凝血等信號通路有關(guān)。

Tab 2 KEGG enrichment analysis of differential expression genes

Fig 2 GO enrichment analysis of differential expression genes

2.4 分子對接結(jié)果將SERPINA1、PLAU、C8B、CD55與CXCL8基因與具有抗補體活性的化合物芍藥苷元酮、白藜蘆醇、雷公藤甲素進行分子對接。分子對接結(jié)果如Tab 3所示，結(jié)果表明芍藥苷元酮與C8B、PLAU、CXCL8結(jié)合能力較強，各化合物與補體與凝血通路中的PLAU、C8B靶蛋白結(jié)合能力較強，其中芍藥苷元酮與雷公藤甲素與C8B的結(jié)合能力最強，其分子對接示意圖如Fig 3、4所示。

Fig 3 Molecular docking diagram of paeoniflorigenone with C8B

Fig 4 Molecular docking diagram of triptolide with C8B

Tab 3 Results of molecular docking

3 討論

NA以肺組織中性粒細胞增多為特點，表現(xiàn)出更嚴重的臨床癥狀，對糖皮質(zhì)激素治療反應(yīng)較差，其具體機制尚未完全明確。為了進一步闡明NA的發(fā)病機制，本研究通過生物信息學(xué)分析方法對GEO數(shù)據(jù)庫GSE137268芯片中NA患者與健康人群中的誘導(dǎo)痰的表達基因分析，獲得了147個差異基因，其中7個為上調(diào)基因，140個為下調(diào)基因。對這些差異基因進行了PPI網(wǎng)絡(luò)分析、GO功能注釋與KEGG通路富集分析。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析得到了10個核心基因，根據(jù)它們的Degree值確定CXCL8基因最為關(guān)鍵。CXCL8作為重要的中性粒細胞趨化因子，趨化與活化中性粒細胞匯集于肺組織，引起肺部炎癥和氣道高反應(yīng)。近年的研究表明[6]，患者肺泡灌洗液中CXCL8的濃度與中性粒細胞的數(shù)量呈正相關(guān)，與FVC/FEV1成明顯的負關(guān)系。本研究通過生物信息學(xué)分析方法進一步證明了CXCL8在NA的致病機制中起關(guān)鍵作用。

KEGG富集分析顯示，差異基因受多種信號通路的調(diào)節(jié)，如細胞因子-細胞因子受體相互作用信號通路、環(huán)磷酸腺苷信號通路，NF-κB信號通路，這些通路在以往的研究中被證實參與了哮喘的炎癥過程[7-9]。此外，我們的研究發(fā)現(xiàn)補體與凝血信號通路參與了NA的病理過程。補體系統(tǒng)是機體重要的免疫系統(tǒng)，在免疫防御中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。補體系統(tǒng)通過經(jīng)典、旁路和凝集素途徑激活后，其活化產(chǎn)物C3a與C5a是重要的趨化因子，募集與活化嗜酸性粒細胞、中性粒細胞等炎癥細胞匯集于肺組織[10]，釋放多種炎癥介質(zhì)如CXCL8、IL-6、IL-1與TNF-α，從而此起氣道高反應(yīng)[11-12]。此外，補體激活產(chǎn)物C5a能直接抑制中性粒細胞凋亡，加重氣道炎癥反應(yīng)[13]。這提示補體系統(tǒng)的激活在NA的發(fā)病機制中起了重要作用。采用抗補體藥物抑制補體系統(tǒng)的激活或許可以達到治療NA的目的。

為了進一步驗證抗補體藥物治療NA的可行性，我們選取了文獻報道具有較強補體抑制活性的芍藥苷元酮、白藜蘆醇與雷公藤甲素3個化合物與補體與凝血通路中的4個基因SERPINA1、PLAU、C8B與CD55以及受多條信號通路調(diào)節(jié)的CXCL8基因進行分子對接[14-16]。分子對接顯示各化合物與上述靶蛋白均具有較好的結(jié)合活性，尤以芍藥苷元酮與雷公藤甲素與C8B的結(jié)合能力最強。C8B是組成攻膜復(fù)合物(membrane attack complex，MAC)的重要成分之一。補體系統(tǒng)異常活化產(chǎn)生的MAC可激活巨噬細胞、中性粒細胞、單核細胞釋放IL-8、IL-1等細胞因子，參與炎癥反應(yīng)[17]。

雷公藤甲素是傳統(tǒng)中藥雷公藤的主要活性成分之一，具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)等藥理活性。黎雄斌等研究發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素可以明顯緩解中性粒細胞哮喘小鼠氣道炎癥，但其機制不明確[18]。本研究通過生物信息學(xué)分析方法和分子對接技術(shù)揭示了雷公藤甲素治療NA的機制可能與其抑制補體系統(tǒng)的過度激活有關(guān)。課題組前期在中藥牡丹皮的抗補體活性成分的篩選過程中發(fā)現(xiàn)芍藥苷元酮具有很好的抗補體活性[14]。本研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷元酮與多個NA相關(guān)的靶蛋白具有很好的結(jié)合活性，其體內(nèi)藥理作用有待后續(xù)研究中進一步驗證。

綜上所述，本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫，運用生物信息學(xué)方法分析了NA的差異表達基因，篩選出的關(guān)鍵基因及信號通路與NA的致病機制密切相關(guān)，進一步通過分子對接技術(shù)發(fā)現(xiàn)芍藥苷元酮與雷公藤甲素與補體與凝血通路的基因蛋白具有良好的結(jié)合活性，可以作為NA的潛在治療藥物。本研究為NA的治療提供了新的思路與方法。